豬MHC 的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

潘孝成

（安徽省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031）

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）是位于脊椎動物某一染色體上一組緊密連鎖、高度多態(tài)性的基因群，根據(jù)其編碼產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分布和功能可分為三類，即MHCⅠ、Ⅱ和Ⅲ。豬的MHC又稱為豬白細(xì)胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA），由Viza D等［1］于1970年發(fā)現(xiàn)。近年來，隨著SLA各方面研究的不斷深入，對SLA在正常免疫以及抗感染和疫苗免疫中角色的了解不斷增多。Ⅰ類SLA與抗原表位多肽的結(jié)合方式及作用機(jī)理已成為研究和關(guān)注的重點(diǎn)。

1 SLA基因及其定位

在豬的基因組中，SLA是密度最高的基因區(qū)之一，其與人的MHC一樣，也由3個基因簇組成，即SLAⅠ、SLAⅡ和SLAⅢ，定位于豬7號染色體的著絲粒的兩邊，SLAⅠ和SLAⅢ位于短臂的7p1.1區(qū)域，SLAⅡ位于長臂的7q1.1［2］。一種常見的豬SLA單倍型Hp－1.1（H01），其整個SLA區(qū)的測序和標(biāo)記已經(jīng)完成。結(jié)果顯示，SLAⅠ、SLAⅢ和SLAⅡ區(qū)域的跨度分別是約1.1×106、0.7×106、0.5×106bp，是哺乳動物中迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小跨度MHC和惟一一個跨越著絲粒的MHC。在整個SLA區(qū)，有超過150個基因已經(jīng)被鑒定，至少121個為功能性基因［3－4］。

在豬白細(xì)胞抗原（SLA）Ⅰ類區(qū)共有7個經(jīng)典的SLAⅠ類基因，最靠近著絲粒的是SLA11，接著是SLA－4、SLA－2、SLA－3、SLA－9、SLA－5 和 SLA－1，其 中SLA－1、－2、－3是功能性基因，其他的4個經(jīng)典的SLAⅠ類基因是假基因。在Ⅰ類區(qū)有3個非經(jīng)典的SLAⅠ類基因（SLA－6、SLA－7、SLA－8），它們位于Ⅰ類區(qū)的著絲粒末端。與人MHCⅠ系統(tǒng)相似，在SLAⅠ區(qū)也存在MHCⅠ鏈相關(guān)基因（MHC classⅠchain－related genes，MIC），包括 MIC－1和 MIC－2，MIC－2預(yù)測是功能性的，MIC－1是假基因［5］，在SLAⅢ類區(qū)同Ⅰ類區(qū)相連，并更靠近著絲粒，在這個區(qū)域有超過60個基因座被鑒定，其中有許多在免疫防御中起重要作用的基因，例如腫瘤壞死因子家族成員（TNF、LTA和LTB）和補(bǔ)體成份（C2、C4A 和 CFB）［3，6］。

在SLAⅡ類區(qū)，有幾個基因座編碼表達(dá)SLAⅡ類抗原，它們編碼表達(dá)SLA－DR、DQ、DM和DO分子的α鏈和β鏈，最靠近著絲粒是SLA－DRA基因，接著是SLA－DRB1、DQA、DQB1、DOB1、DMB、DMA和DOA。SLAⅡ類假基因有SLA－DRB2、DRB3、DRB4、DRB5、DQB2、DOB2和wDYB。同人的MHCⅡ系統(tǒng)相似，豬抗原遞呈相關(guān)基因，例如TAP基因（TAP1和TAP2）和蛋白酶體β亞單位基因（PSMB8和PSMB9，舊稱LMP7和LMP2），定位在DOB1和DMB基因座之間［5－7］（圖1）。

2 SLA的基因結(jié)構(gòu)與分子功能

經(jīng)典的SLAⅠ基因由8個外顯子組成，外顯子1編碼前導(dǎo)序列，外顯子2－4編碼相應(yīng)的α1、α2和α3功能區(qū)，外顯子5編碼跨膜區(qū)，外顯子6－8編碼胞內(nèi)區(qū)。所有表達(dá)的經(jīng)典SLAⅠ在編碼區(qū)高度相似，SLA－1和SLA－3的非翻譯區(qū)也非常相似，同它們相比，SLA－2的前導(dǎo)序列長9bp。非經(jīng)典的SLAⅠ基因結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的SLAⅠ基因相似，不同之處是其胞內(nèi)區(qū)由2個外顯子編碼［8］。SLAⅡ的α鏈基因由4個外顯子組成，外顯子1編碼前導(dǎo)序列，外顯子2、3分別編碼α1、α2功能區(qū)，外顯子4編碼跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。同α鏈相比，SLAⅡ的β鏈分子基因結(jié)構(gòu)與之基本相同，SLA－DQB1在胞內(nèi)區(qū)多1個編碼外顯子，SLA－DRB1在胞內(nèi)區(qū)多2個編碼外顯子［9］（圖2）。研究發(fā)現(xiàn)SLA－DQB基因的外顯子2存在高度多態(tài)性，這種多態(tài)性與Ⅱ類抗原的生物學(xué)特性有著密切的關(guān)系［10］。

豬β2m基因定位于1號染色體。經(jīng)典的功能性SLAⅠ分子由重鏈（α鏈）和輕鏈（β2m）組成，它們表達(dá)于所有有核細(xì)胞的表面，主要功能是遞呈內(nèi)源性抗原多肽給CD8＋T細(xì)胞。它們也與自然殺傷性細(xì)胞（natural killer，NK）相互作用，阻止NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性［11］。已有的研究提示，在豬體內(nèi)SLA－1表達(dá)水平最高，SLA－2次之，SLA－3表達(dá)水平最低［5］。非經(jīng)典的SLAⅠ分子和MIC分子的功能還需要進(jìn)一步研究確定。表達(dá)的SLAⅡ抗原（SLA－DR、SLA－DQ）發(fā)現(xiàn)主要分布于專業(yè)的抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）上，例如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞［12］；它們在各種毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)也有報道；意料之外的是，T細(xì)胞表達(dá)SLAⅡ抗原，并且優(yōu)先表達(dá)在CD8＋T細(xì)胞上；另外，在CD2＋CD8＋γδT細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)有SLAⅡ抗原的表達(dá)。SLAⅡ抗原主要功能是遞呈外源性抗原多肽給CD4＋T細(xì)胞［7］。

圖1 SLAⅠ、SLAⅡ和SLAⅢ類區(qū)域基因物理圖譜Fig.1 Physical map of SLAⅠ，SLAⅡand SLAⅢgenes

圖2 SLA基因的分子構(gòu)成示意圖Fig.2 Schematic molecular organization of the SLA genes.

3 SLA基因的多態(tài)性

到目前為止，在免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（immunopolymorphism database，IPD）的 SLA 序 列 庫 （http：／／www.ebi.ac.uk／ipd／mhc／sla／）中，有116條已經(jīng)鑒定的經(jīng)典的SLAⅠ等位基因，另外還有13條非經(jīng)典的SLAⅠ等位基因，分析發(fā)現(xiàn)，SLA－1、SLA－2、SLA－3基因具有高度的多態(tài)性。在這些鑒定的SLAⅠ基因中，44條SLA－1基因可分為12個等位基因組，26條SLA－3基因和46條SLA－2基因則分別可分為7和14個等位基因組。而SLAⅠ基因的高度多態(tài)性主要集中在外顯子2和3，它們編碼的SLAⅠ重鏈的α1和α2功能區(qū)形成抗原肽結(jié)合槽。另外，還發(fā)現(xiàn)幾個SLAⅠ等位基因的長度存在差異，目前還不知道這種長度變化會不會影響表達(dá)蛋白的完整性，從而改變它們的表面表達(dá)。非經(jīng)典的SLA－6、SLA－7和SLA－8已經(jīng)鑒定的等位基因分別有9、2和2個，在這9個SLA－6等位基因之間，僅存在非常少的核甘酸差異，另外2個SLA－7有8個核甘酸位點(diǎn)的不同，2個SLA－8有7個核甘酸位點(diǎn)的不同。在IPD－MHC SLA序列庫，有164條已經(jīng)鑒定的經(jīng)典的SLAⅡ等位基因，其中α鏈和β鏈的等位基因分別有38條（13DRA、20DQA和5DMA）和126條（82DRB1和44 DQB1）［13］。

4 SLA限制性T細(xì)胞抗原表位分析

有關(guān)SLA限制性T細(xì)胞抗原表位的鑒定及應(yīng)用研究已有近20年的歷史，結(jié)果是以不同的方法、在不同層次上獲取一些病原的T細(xì)胞抗原表位信息。Pauly T等［14］通過合成一系列來源豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的重疊肽，鑒定出一條SLAⅠ限制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T－lymphocyte，CTL）細(xì)胞表位（氨基酸序列為ENALLVALF），雖然不知道該序列的具體的限制性SLAⅠ基因，但知道該SLAⅠ基因來自 MHC單倍型為d／d（Hp－4a.0）的NIH小型豬。Ramachandran S等［15］通過酸洗脫的方法，從豬的主動脈細(xì)胞上獲得了一些SLAⅠ分子結(jié)合的豬內(nèi)生性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retroviruses，PERV）的來源多肽，研究證實(shí)有兩條多肽能夠有效引起人的CTL細(xì)胞的反應(yīng)。Gao F S等［16］合成的兩個來源豬口蹄疫病毒（Foot－and－mouth disease virus，F(xiàn)MDV）VP1蛋白的9肽，氨基酸序列分別為RRQHTDVSF和RTLPTSFNY，這兩個多肽能夠與SLA－2－（G4S）3－β2m單鏈復(fù)合體蛋白結(jié)合，并能使免疫小鼠產(chǎn)生CD8＋T細(xì)胞的反應(yīng)。Molder T等［17］用艾滋病病毒（HIV－1）DNA疫苗接種豬，免疫結(jié)束后，分離外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），用合成的HIV－1多肽刺激，發(fā)現(xiàn)一些能夠引起IFN－γ分泌增加的多肽，它們在HIV－1的位置與已鑒定的人MHCⅠ限制的HIV－1表位基本相同。Díaz I等［18］利 用 MAPPP 網(wǎng) 站 （http：／／www.mpiib－berlin.mpg.de／MAPPP／binding.html）預(yù)測合成了一些豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）來源多肽，用PRRSV－LV株弱毒疫苗免疫長白豬后，分離PBMC，加入合成的多肽刺激，通過檢測IFN－γ產(chǎn)生情況，確定了5條SLAⅠ限制性多肽和3條SLAⅡ限制性 多 肽。Hoof I等［19］利 用 NetMHCpan（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetMHCpan／）預(yù)測并鑒定了13條能夠結(jié)合于SLA－1＊0401的多肽，并且SLA－1＊0401對其中5條多肽有強(qiáng)的結(jié)合性。

5 SLA分子的結(jié)構(gòu)研究

SLA分子三維結(jié)構(gòu)的解析，將有助于闡明SLAⅠ或SLAⅡ與多肽的結(jié)合規(guī)律，了解病原的SLA限制性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的特征和分子基礎(chǔ)，目前這方面的研究較少，并且主要集中在SLAⅠ類分子上。Oleksiewicz M B等［20］開始了體外構(gòu)建豬SLAⅠ復(fù)合物分子的嘗試，他們用連接肽將SLAⅠ分子的重鏈、β2m和病毒多肽連接成一條單鏈，證實(shí)了該單鏈復(fù)合體能夠在體外正確的折疊。Gao F S等［21－22］用一個富含甘氨酸和絲氨酸的linker（G4S）3，采用剪接延伸PCR（splicing overlap extention PCR，SOE PCR）法，將巴馬小型豬SLA－2的胞外區(qū)和β2m成熟肽基因相連成基因鏈SLA－2－（G4S）3－β2m，將SLA－2的胞外區(qū)、β2m成熟肽基因和 SLA－2－（G4S）3－β2m 分別插入 pMAL－p2X質(zhì)粒進(jìn)行可溶性表達(dá)，得到的蛋白經(jīng)Amylose樹脂親和層析、Factor Xa蛋白酶切、DEAE糖分子篩進(jìn)行分離和純化，純化的SLA－2、β2m和SLA－2－（G4S）3－β2m蛋白采用圓二色譜（SD）測定它們的二級結(jié)構(gòu)（2D），并在此基礎(chǔ)上，同源模建了巴馬小型豬SLA－2和β2m蛋白的三級結(jié)構(gòu)（3D）。

潘孝成等［23－24］首次報道了 SLAⅠ分子（SLA－1＊1502）與來自PRRSV來源多肽（NSP9TY9）復(fù)合物三維晶體結(jié)構(gòu)的解析，解析的結(jié)構(gòu)表明，其整體結(jié)構(gòu)與已解析的人及其他動物的MHCⅠ類分子結(jié)構(gòu)相似，且多肽結(jié)合的錨定殘基也為多見的P2位和Pc位氨基酸。同其他MHCⅠ類分子相比，SLA－1＊1502的多肽結(jié)合槽有一個大的B口袋，使該口袋可容納的氨基酸種類增加，依靠這個基礎(chǔ)，相比于對結(jié)合多肽有更多挑剔的MHCⅠ分子，SLA－1＊1502有更多的機(jī)會去限制性結(jié)合關(guān)鍵性的抗原表位多肽。另外潘孝成等還解 析 了 SLA－1＊1502、鼠 β2m（mβ2m）和 多 肽NSP9TY9復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這兩個SLA－1＊1502的結(jié)構(gòu)中，SLA－1＊1502的主鏈碳原子（Cα）構(gòu)象在實(shí)驗(yàn)誤差的范圍內(nèi)相同，且mβ2m和豬β2m（sβ2m）與SLA－1＊1502形成氫鍵的氨基酸高度保守。這方面的研究為將SLAⅠ轉(zhuǎn)入鼠中開展相關(guān)的免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。同年，張念之等［25－26］解析了SLAⅠ分子（SLA－1＊0401）與來自流感病毒及埃博拉病毒的多肽（S－OIVNW9、EbolaAY9）復(fù)合物結(jié)構(gòu)，SLA－1＊0401分子的突出特點(diǎn)是位于D口袋的156位精氨酸（Arg156）具有對多肽結(jié)合的“否定權(quán)”。Arg156的側(cè)鏈以不同的方式分別結(jié)合多肽S－OIVNW9、EbolaAY9，并造成了兩個結(jié)構(gòu)中C、D口袋構(gòu)象的改變。突變體SLA－1＊0401－H－Ala156擴(kuò) 大 了 多 肽 結(jié) 合 譜，證 明Arg156在多肽結(jié)合中起限制性作用。

6 展望

目前，有關(guān)豬SLA的研究主要集中在基因的克隆、序列多態(tài)性分析、基因組結(jié)構(gòu)、染色體定位以及其在抗感染和疫苗反應(yīng)中的所充當(dāng)?shù)慕巧确矫?，而涉及SLA分子與抗原表位多肽的結(jié)合方式及作用機(jī)理等方面研究則相對較少。2011年兩個SLAⅠ分子晶體結(jié)構(gòu)的解析將有助于闡明SLAⅠ與多肽的結(jié)合規(guī)律，了解SLAⅠ限制性CTL免疫應(yīng)答的特征和分子基礎(chǔ)。當(dāng)前SLA研究應(yīng)該聚焦于深入探究具體SLA等位基因在控制免疫反應(yīng)中的角色、測定感染和免疫后所產(chǎn)生的具體抗原表位以及定量分析抗原特異性T淋巴細(xì)胞等方面。

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