湖南省豬源糞腸球菌AFLP分析

田世成，黎滿香，蔣 偉，林榮高，郭洪香，屈泰龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

糞腸球菌是棲居于人類或動(dòng)物胃腸道的正常菌群，也可定植于口腔和陰道，且廣泛分布于自然界中。它們能獲得特定的基因決定簇，比如毒力因子和耐藥性決定簇，使其適應(yīng)各種生態(tài)系的能力增強(qiáng)［1］。目前，對(duì)糞腸球菌的種群結(jié)構(gòu)和全球流行病學(xué)了解還是非常有限［2］，特別是對(duì)動(dòng)物來源菌株。在獸醫(yī)臨床中近年來不斷有動(dòng)物感染的報(bào)道［3－4］，且腸球菌屬在獸醫(yī)臨床標(biāo)本中的分離率也不斷增加。目前，對(duì)腸球菌的鑒定仍依靠傳統(tǒng)表型特征的檢測(cè)作為重要的鑒定方法。但由于許多腸球菌種間的表型特征非常接近，因此鑒定起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以至錯(cuò)失治療時(shí)機(jī)，使病情得不到及時(shí)的控制。不少的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于糞腸球菌的流行病學(xué)分析［5］，擴(kuò) 增 片 段 長 度 多 態(tài) 性 （amplified fragment length polymorphism，AFLP）方法可以用來獲得細(xì)菌基因型信息［6］。采用AFLP技術(shù)在鏈霉菌菌種鑒定上也是一種方便有效的工具［7］。本試驗(yàn)以從不同發(fā)病豬場(chǎng)分離出的42個(gè)分離株為研究對(duì)象，在表型鑒定符合糞腸球菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了AFLP及系統(tǒng)進(jìn)化分析研究，旨在對(duì)該菌進(jìn)行分類分型，用以追溯傳染源，了解湖南省豬場(chǎng)糞腸球菌引起感染的情況及主要基因類群的分布差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)所用菌株包括標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212，臨床分離株42株，主要從病豬肺、脾、腦、淋巴結(jié)等處分離。其中長沙分離8株、永州7株、婁底5株、郴州4株、岳陽3株、益陽3株、邵陽3株、懷化2株、衡陽1株、株洲1株，還有5株不能確定到市級(jí)地區(qū)。

1.1.2 主要試劑EcoRⅠ、MseIw，購自加拿大Fermentas公司；T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNA 1adder、100bp DNA ladder，購自寶生物（大連）有限公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀（ABI 2720型），美國ABI公司；DYY－6C型電泳儀、DYPZ－24E型電泳槽，北京六一儀器廠；5415D型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國eppendorf公司；AYJI－1002－U型超純水儀，臺(tái)灣艾科浦公司；SHA－B型水浴恒溫震蕩器，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 TSB 培養(yǎng)基（Fluka）使用時(shí)按30g／L配制。

1.2 方法

1.2.1 引物及接頭序列 接頭序列根據(jù)基因組及酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)（EcoRⅠ接頭，MseⅠ接頭），引物參考文獻(xiàn)［8］，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。EcoRⅠ 接頭序列：5′－CTCGTAGACTGCGTACC－3′， 5′－CATCTGACGCATGGTTAA－3′；MseⅠ接頭序列：5′－GACGATGAGTCCTGAG－3′，5′－TACTCAGGACTCAT－3′。EcoRⅠ PCR 擴(kuò)增 引 物：5′－GACTGCGTACCAATTC－3′（核 心 序列），MseⅠ PCR 擴(kuò)增引物：5′－GATGAGTCCTGAGTA－3′（核心序列）。引物組分別標(biāo)記為EcoRⅠ＋1／＋2／＋3，MseⅠ＋1／＋2／＋3。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 取出保存菌種接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h，染色鏡檢后收集菌液備用。采用酚氯抽提法進(jìn)行DNA提?。?］。

1.2.3 限制性酶切及連接 酶切使用雙酶切法，EcoRⅠ（10U／μL），MseⅠ（10U／μL）；37℃作用4h后轉(zhuǎn)到65℃繼續(xù)4h，95℃作用20min使酶失活，酶切后用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶切效果。連接用T4DAN連接酶連接酶切產(chǎn)物與EcoRⅠ接頭和MseⅠ接頭；于16℃連接4h后再95℃作用10min失活T4 DNA連接酶，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增及引物篩選 預(yù)擴(kuò)增，使用引物組EcoRⅠ＋1和MseⅠ＋1預(yù)擴(kuò)增，連接產(chǎn)物作模板，PCR體系50μL。置PCR儀中運(yùn)行20個(gè)循環(huán)。選擇性擴(kuò)增，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，反應(yīng)體系50μL，模板（稀釋后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物），PCR采取梯度退火方法，即起始退火溫度設(shè)為65℃，然后每2循環(huán)后退火溫度降1℃，直到退火溫度為55℃后不再降低退火溫度。擴(kuò)增產(chǎn)物用20g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定是否擴(kuò)增成功和聚丙烯酰胺電泳時(shí)上樣的量。最佳引物的篩選，對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行組合，分別按照預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增進(jìn)行篩選獲得最佳的引物對(duì)。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 凝膠電泳，80 g／L聚丙烯酰胺凝膠，每孔加8μL樣品（6×上樣緩沖液），同時(shí)每板加一孔5μL 100bp DNA標(biāo)準(zhǔn)；70 V電壓電泳5h。硝酸銀染色，顯色清晰后加入純凈水終止；再漂洗1次，成像系統(tǒng)拍照。AFLP圖譜的分析，在獲得選擇性擴(kuò)增圖譜后進(jìn)行讀帶，有條帶記錄為“1”，無條帶記錄為“0”。然后用 NTSYSpc－2.10e中算術(shù)平均非加權(quán)對(duì)群法（UPGMA）進(jìn)行類聚分析。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)擴(kuò)增

在經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)AFLP應(yīng)有的smear現(xiàn)象，即電泳出現(xiàn)拖尾、彌散現(xiàn)象（圖1）。因此，可進(jìn)行下一步選擇性擴(kuò)增。

圖1 初步擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of preliminary amplification（primer E＋G／M＋T）

2.2 選擇性擴(kuò)增

在瓊脂糖凝膠電泳圖譜（圖2）中可見明亮的條帶，說明選擇性擴(kuò)增成功，可以將樣品進(jìn)行80g／L聚丙烯酰胺凝膠電泳。

在80g／L聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（圖3）中獲取比瓊脂糖更多條帶的AFLP圖譜。泳道8為100bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，其余各泳道對(duì)應(yīng)不同的菌株（僅列部分，其余見圖4）。

圖2 選擇性擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 The results of selected amplification distinguished in agarose gel（primer E＋GC M＋TG）

圖3 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.3 The results of selected amplification distinguished in polyacrylamide gelatin（primer E＋GC M＋TG）

2.3 湖南糞腸球菌的AFLP聚類分析結(jié)果

由湖南豬源糞腸球菌AFLP聚類分析樹狀圖上可知，所有42菌株可以分為3個(gè)大簇，定義為A、B、C。分離于關(guān)節(jié)的菌株主要分布于相似性約在63.0%的D、E兩簇上，來自于長沙的CS64，CS81，CS86，CS76有著極相似的圖譜，分布于D1簇。按照相似性為75.0%分類可以獲得21種基因型，其中11種基因型且分離到一個(gè)菌株。

3 討論

3.1 AFLP圖譜的分型效果

本試驗(yàn)運(yùn)用AFLP對(duì)湖南豬源糞腸球菌的DNA多態(tài)性進(jìn)行分析。需要指出的是本試驗(yàn)在進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)沒有一塊玻璃板能夠同時(shí)裝載42樣個(gè)本，只能分裝成3塊同時(shí)配制相同規(guī)格的凝膠，使得3板間的DNA Marker條帶略有偏差，因此在讀帶時(shí)做了相應(yīng)的調(diào)整。試驗(yàn)結(jié)果表明湖南地區(qū)分離到的糞腸球菌在基因上存在多樣性，從本次獲得的AFLP圖譜中相似性最小的僅有50%，可區(qū)分3個(gè)大簇A、B、C，按照相似性為75%分類可以獲得21種基因型。根據(jù)以往的工作，應(yīng)用16SrDNA序列描述菌株差異性，湖南分離株的同源性都大于98%，因此，來源于病豬的湖南分離株的16S rDNA變異并不大，在進(jìn)化樹上未能體現(xiàn)湖南分離株的地域性差異。由此可見，AFLP在描述種內(nèi)菌株的差異，特別是檢驗(yàn)地緣關(guān)系相近的分離株時(shí)有較大的優(yōu)勢(shì)。

3.2 關(guān)于引物的篩選及AFLP的條件

在進(jìn)行多態(tài)性分析時(shí)，條帶的數(shù)目要求適量，過多則會(huì)導(dǎo)致電泳時(shí)難分離開及統(tǒng)計(jì)分析困難，過少又不能反映菌株間的差異，因此調(diào)控圖譜條帶數(shù)目對(duì)于AFLP分析至關(guān)重要。假設(shè)基因組堿基A、G、T、C所占比例是一樣的，那么在核心序列末端每多加上1個(gè)堿基，理論上擴(kuò)增出的條帶數(shù)目就會(huì)減少3／4。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物的核心序列部分與接頭序列互補(bǔ)配對(duì)，且分別設(shè)計(jì)了核心序列＋1、＋2、＋3的多種引物組合，以尋求獲取最佳AFLP圖譜。試驗(yàn)結(jié)果表明在預(yù)擴(kuò)增時(shí)使用引物E＋G／M＋T和選擇性擴(kuò)增時(shí)使用E＋GC／M＋TG獲得的圖譜最為理想，如果用核心序列＋3則條帶明顯減少，不利分析。從這點(diǎn)看體現(xiàn)了AFLP技術(shù)在獲得條帶數(shù)目方面的靈活可調(diào)性。電泳電壓對(duì)AFLP圖譜也有很大影響，在試驗(yàn)中不同的電泳儀不同的樣品都要求不同的電泳條件。本試驗(yàn)中電泳電壓為70V時(shí)獲得較理想的圖譜。

圖4 AFLP分析結(jié)果Fig.4 A dendrogram based on AFLP analysis generated by UPGMA

3.3 湖南分離株的AFLP圖譜與表型的相關(guān)性

DNA指紋技術(shù)常被用于追蹤傳染源、調(diào)查傳播途徑、推斷流行方式，其精確性是傳統(tǒng)方法不能比擬的。有人通過母代家畜和后代家畜體內(nèi)分離株的DNA指紋差異證明該微生物的傳播方式為垂直傳播［10］。本試驗(yàn)從AFLP圖譜看，分離株CS64、CS81和CS86有著很近的親緣關(guān)系，在此推斷，這4株可能由同一菌株克隆而來，糞腸球菌可能在這一地區(qū)內(nèi)豬場(chǎng)間相互傳播。此外，還有YZ02、YZ03、CS85和CS13估計(jì)也是屬于同一菌株克隆而來。毒力基因型asa1＋EF0591－efaA＋EF3314＋esp＋gelE＋cylA＋ace＋的菌株比較集中于 A簇，而所獲得AFLP圖譜與耐藥型菌株沒有明顯的相關(guān)性。研究表明AFLP圖譜乃至其他DNA指紋技術(shù)都能很清晰描述菌株的圖譜差異，但是否與表型相關(guān)則需要做表型試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照，而且一種反應(yīng)體系或條帶圖譜往往不能與多個(gè)表型表現(xiàn)相關(guān)。

本試驗(yàn)應(yīng)用AFLP分析技術(shù)，再結(jié)合以往對(duì)該分離株初步鑒定，不但進(jìn)一步確定了其分屬不同的種，并了解不同地理種群已出現(xiàn)了分化。在此，我們的結(jié)果也很難與耐藥性、毒力等相關(guān)表型信息同時(shí)關(guān)聯(lián)，且要用AFLP圖譜描述與各個(gè)表型的相關(guān)性還有待深入研究。

［1］Mundy L M，Sahm D F，Gilmore M.Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance［J］.Clin Microbiol Rev，2000，3：513－522.

［2］Garbajosa P R，Bonten J M，Robinson D A，et al.Multilocus sequence typing scheme forEnterococcusfaecalisreveals hospital－adapted genetic complexes in a background of high rates of recombination［J］.Clin Microbiol，2006，44：2220－2228.

［3］陳一資，蔣文燦，胡 濱.對(duì)鴨場(chǎng)爆發(fā)罕見糞腸球菌病的研究［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，（23）4：324－325.

［4］王亞賓，胡清林，陳麗穎，等.一株致仔豬關(guān)節(jié)炎糞腸球菌的鑒定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（S1）：157－161.

［5］Waar K，Muscholl－Silberhorn A B，Willems R J，et al.Genogrouping and incidence of virulence factors ofEnterococcus faecalisin liver transplant patients differ from blood culture and fecal isolates［J］.Infect Dis，2002，185：1121－1127.

［6］魯辛辛，王 玫，周 宇.細(xì)菌核酸分類鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（6）：394－397.

［7］Lanoota B，Vancanneyta M，Hostea B，et al.Phenotypic and genotypic characterization of mutants of the virginiamycin producing strain 899and its relatedness to the type strain ofStreptomycesvirginiae［J］.Syst Appl Microbiol，2005，28：77－84.

［8］Woodford N，Adebiyi A M，Palepou M F，et al.Diversity of VanA glycopeptide resistance elements in enterococci from human and nonhuman sources［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42：502－508.

［9］李金鐘.腸球菌分類與鑒定新進(jìn)展［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2006，24（3）：228－230.

［10］Amass S F，Sanmiguels P，Clark L K.Demonstration of vertical transmission ofStreptococcussuisin swine by genomic fingerprinting［J］.Clin Microbiol，1997，35（6）：1595－1959.