樺褐孔菌多糖對(duì)急性感染弓形蟲(chóng)小鼠血清中IL－1β及IL－12含量的影響

姚 琳，王韻箎，鞠玉琳

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133002）

剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii）是一種機(jī)會(huì) 性寄生原蟲(chóng)，在細(xì)胞免疫功能缺陷、受損或者先天性弓形蟲(chóng)感染的人群中常有較高的發(fā)病率和死亡率［1－3］，剛地弓形蟲(chóng)可感染人和多種動(dòng)物，引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。李佳佳等［4］證明樺褐孔菌多糖能促進(jìn)急性感染弓形蟲(chóng)小鼠細(xì)胞因子IL－2、IFN－γ的釋放，達(dá)到抗弓形蟲(chóng)的目的。本試驗(yàn)通過(guò)研究樺褐孔菌多糖對(duì)急性感染弓形蟲(chóng)小鼠血清中細(xì)胞因子IL－12、IL－1β的影響，為樺褐孔菌多糖治療急性感染弓形蟲(chóng)小鼠早期作用機(jī)制提供理論依據(jù)，進(jìn)一步在分子免疫水平上探討樺褐孔菌多糖抗弓形蟲(chóng)的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 樺褐孔菌多糖的提取方法在文獻(xiàn)［5］方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，獲得的樺褐孔菌多糖含量為49.45%。小鼠血清IL－12、IL－1βELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自RB公司。

1.1.2 蟲(chóng)株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 弓形蟲(chóng)RH株由日本帶廣原蟲(chóng)病研究所惠贈(zèng)，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室保種，液氮保存。昆明種小鼠，體重18g～22g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 急性感染弓形蟲(chóng)小鼠模型的建立 接種RH株的小鼠72h后處死，并用生理鹽水洗滌腹腔，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)備用。除陰性組外，其余各組小鼠腹腔接種RH株弓形蟲(chóng)速殖子102個(gè)／只，陰性組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2mL／只。在感染前3d開(kāi)始灌胃樺褐孔菌多糖，總共6d。

1.2.2 小鼠血清的制備及細(xì)胞因子IL－12、IL－1β的測(cè)定 取健康雄性昆明種小鼠45只，隨機(jī)分為3組，即陰性組，急性感染弓形蟲(chóng)小鼠模型組，樺褐孔菌多糖試驗(yàn)組。陰性組及模型組每天灌胃蒸餾水0.2mL／只，試驗(yàn)組每天灌胃樺褐孔菌多糖0.2 mL／只。于接種后12、24、36、48、60h摘眼球采血，分離血清，置－20℃保存?zhèn)溆?。用時(shí)分別將IL－1β、IL－12組待測(cè)血清原倍、100倍稀釋?zhuān)丛噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)所給標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將OD值換算成濃度（pg／mL）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì) 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果用±SD表示。數(shù)據(jù)差異顯著性采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清中IL－12的測(cè)定

分別在12、24、36、48、60h采集陰性組、模型組、試驗(yàn)組的小鼠全血，分離血清，用時(shí)將待測(cè)血清稀釋100倍，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，將OD值換算成濃度如表1所示。

由表1可知，陰性組中不同時(shí)間之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；模型組中不同時(shí)間比較均呈極顯著差異（P＜0.01）；試驗(yàn)組中24h和60h比較差異不顯著（P＞0.05），12、36、48h相比較均呈極顯著差異 （P＜0.01）；模型組和試驗(yàn)組與陰性組比較均呈極顯著差異 （P＜0.01）；模型組及試驗(yàn)組IL－12的峰值均出現(xiàn)在36h，48h開(kāi)始下降，但試驗(yàn)組IL－12值一直高于陰性組，低于模型組。

2.2 小鼠血清中IL－1β的測(cè)定

分別在12、24、36、48、60h采集陰性組、模型組、試驗(yàn)組的小鼠全血，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，將OD值換算成濃度如表2所示。

表1 各組小鼠不同時(shí)間血清中IL－12水平比較Table1 The serum level of IL－12in different time among different groups in mice

表2 各組小鼠不同時(shí)間血清中IL－1β水平比較Table 2 The serum level of IL－1βin different time among different groups in mice

由表2可知，陰性組中不同時(shí)間之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；模型組中不同時(shí)間比較均呈極顯著差異（P＜0.01）；試驗(yàn)組中12、48、60h比較差異不顯著（P＞0.05），24h和36h比較呈極顯著差異（P＜0.01）；模型組和試驗(yàn)組與陰性組比較均呈極顯著差異 （P＜0.01）；模型組及試驗(yàn)組的IL－1β峰值均出現(xiàn)在24h，36h開(kāi)始下降，但試驗(yàn)組IL－1β值一直高于陰性組，低于模型組。

3 討論

宿主感染弓形蟲(chóng)后，多種細(xì)胞和細(xì)胞因子在機(jī)體免疫中起重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)29種白介素（IL），在細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血以及炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能［6］。IL－1β由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是早期免疫反應(yīng)的介質(zhì)，能促進(jìn)IL－2、IFN－γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的殺蟲(chóng)活性。IL－12［7－8］由巨噬細(xì)胞分泌，其通過(guò)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞等產(chǎn)生IFN－γ、TNF－α等細(xì)胞因子來(lái)殺傷弓形蟲(chóng)［9］。本研究結(jié)果顯示，用藥3d后模型組和試驗(yàn)組小鼠血清中細(xì)胞因子IL－12和IL－1β表達(dá)量分別在36h和24h達(dá)到高峰，而后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而試驗(yàn)組于用藥3d后在12h～60h期間IL－12、IL－1β值一直高于陰性組，低于模型組，表明樺褐孔菌多糖能夠抑制急性感染弓形蟲(chóng)小鼠血清中細(xì)胞因子IL－1β、IL－12的過(guò)度釋放。至于樺褐孔菌多糖對(duì)急性感染弓形蟲(chóng)小鼠血清中細(xì)胞因子IL－12和IL－1β的調(diào)節(jié)，是否通過(guò)影響IL－2、IFN－γ而間接達(dá)到抗蟲(chóng)目的，還有待于進(jìn)一步研究。

李佳佳等［5］試驗(yàn)結(jié)果證明，樺褐孔菌多糖可使急性感染弓形蟲(chóng)小鼠血清中IFN－γ、IL－2值升高到適當(dāng)水平，并可有效調(diào)節(jié)染蟲(chóng)小鼠CD4＋、CD8＋T細(xì)胞比例；劉妍等［10－11］的病理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果證明，樺褐孔菌多糖能減輕染蟲(chóng)小鼠病理?yè)p傷，提高染蟲(chóng)小鼠生殖器官機(jī)能，促進(jìn)染蟲(chóng)小鼠及孕鼠功能胎鼠的發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明，樺褐孔菌多糖能夠抑制急性感染弓形蟲(chóng)小鼠血清中細(xì)胞因子IL－1β、IL－12的過(guò)度釋放。上述結(jié)果充分的說(shuō)明樺褐孔菌多糖能有效的通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠的細(xì)胞免疫功能來(lái)減輕弓形蟲(chóng)病對(duì)機(jī)體的傷害。本試驗(yàn)用為樺褐孔菌多糖治療急性感染弓形蟲(chóng)小鼠早期作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為弓形蟲(chóng)病的防控提供了新思路。

［1］Dubey J P.Toxoplasmosis of Animals and Humans［M］.2nd ed.CRC Press Inc.Boca Raton：New York，2009：1－313.

［2］從 偉，吳松明，黃思揚(yáng)，等.野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)病研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（2）：83－86.

［3］劉 陽(yáng)，殷麗天，孟曉麗，等.弓形蟲(chóng)STAg聯(lián)合IFN－γ佐劑滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)不同粘膜部位抗體水平動(dòng)態(tài)觀(guān)察［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2011，6（2）：125－128.

［4］李佳佳，鞠玉琳，張厚雙，等.樺褐孔菌多糖對(duì)感染弓形蟲(chóng)小鼠治療作用及其對(duì)血清中細(xì)胞因子含量的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011，43（1）：20－23.

［5］李佳佳，鞠玉琳，李 楊，等.樺褐孔菌不同提取物抗弓形蟲(chóng)效果的比較［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：119－122.

［6］Roman E，Zamir C S，Rilkis I，et al.Congenital toxoplasmosisprenatal aspects ofToxoplasmagondiiinfection［J］.Repiod Toxicol，2006，21（5）：458－472.

［7］Robert B，Dipti V，Christine A.IL－12and related cytokines：Function and regulatory implications in Candida albicans infection［J］.Clin Develop Immunol，2011，10：1－9.

［8］OGarra A，Murphy K M.From IL－10to IL－12：how pathogens and their products stimulate APCs to induce TH1development［J］.Nature Immunol，2009，10（9）：929－932.

［9］Zenner L，Darcy F，Capron A，et al.Toxoplasmagondii：kinetics of the dissemination in the host tissues during the acute phase of infection of mice and rats［J］.Exp Parasitol，2005，90（3）：86－94.

［10］劉 妍，鞠玉琳，劉立本，等.樺褐孔菌粗多糖對(duì)急性弓形蟲(chóng)感染雄性小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（19）：10474－10475.

［11］劉 妍，鞠玉琳，劉立本.樺褐孔菌多糖對(duì)弓形蟲(chóng)感染孕鼠生殖器官及其胎鼠發(fā)育的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（11）：31－33.