通心絡(luò)超微粉對缺血性腦卒中大鼠微血管新生影響的實驗研究

常麗萍，張秋燕，韓建科，魏 聰，賈振華，3

(1.河北以嶺醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡(luò)病)，2.河北省絡(luò)病重點實驗室，河北石家莊 050035;3.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡(luò)病學重點學科，河北石家莊 050091)

腦血管病已成為危害我國中老年人身體健康的主要疾病。最近調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在腦血管病患者中缺血性腦卒中占68%［1］。因此，提高缺血性腦卒中的治愈率，降低致殘率，已成為當前一項刻不容緩的重要任務(wù)。腦缺血發(fā)生后機體通過增加受損區(qū)的氧供代償這種破壞性的影響，其中一種重要的機制就是誘導血管新生，但機體的這種反應(yīng)尚不足以改善腦缺血后的神經(jīng)功能康復。中醫(yī)藥在促進腦缺血后微血管新生方面具有優(yōu)勢，可彌補這種不足，促進腦缺血后血管生成，從而有利于神經(jīng)功能的恢復。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康SPF級♂ SD大鼠48只，體質(zhì)量110～140 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2006-2009。飼養(yǎng)在河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理實驗室，光照12 h/d，溫度20℃ ～23℃，相對濕度40% ～60%。

1.2藥物和試劑通心絡(luò)(Tongxinluo，TXL)超微粉(由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成的棕褐色粉末)，0.076 g(生藥)/kg體質(zhì)量，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號20090430);尼莫地平(拜耳醫(yī)藥保健公司提供，批號H20003010);NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20100519);VEGF ELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司，批號Z1ZFBZAA02);CD31羊抗鼠多克隆抗體(美國Santa Cruz公司提供，批號sc-1506)。

1.3主要儀器SANYO超低溫冰箱(日本三洋公司);SZ-PT解剖顯微鏡(日本OLYMPUS公司);DT-2000電子天平(美國雙杰兄弟(集團)有限公司);XD711酶標儀(上海迅達醫(yī)療器械公司)。

1.4模型制作參照文獻［2］，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，側(cè)臥位，于左側(cè)眼眶后至耳的中點縱形切開皮膚1.5 cm左右，沿顳骨緣剪開顳肌筋膜，完全暴露顳骨的顳鱗和蝶骨大翼，在顴弓上方顳鱗與蝶骨大翼交界處鉆孔，用血管鉗向下方咬骨做3～5mm骨窗，切開硬膜可見橫過嗅束向上行走的大腦中動脈，用11/0號手術(shù)線結(jié)扎大腦中動脈中段。假手術(shù)組大鼠只挑開腦膜，不結(jié)扎血管，于手術(shù)創(chuàng)面撒少許青霉素藥粉，隨后分層縫合肌肉和皮膚，單籠飼養(yǎng)。

1.5動物分組及給藥參照Bederson等［3］方法稍加改進，對大鼠神經(jīng)功能障礙程度進行評分:0分，無任何神經(jīng)功能喪失;1分，右前肢不能充分伸展;2分，提尾時向右環(huán)形或旋轉(zhuǎn)運動;3分，向右轉(zhuǎn)圈，成追尾狀或向右傾倒;4分，不能自然行走或無自發(fā)活動意識障礙者。神經(jīng)功能障礙評分為1～3分的大鼠進行隨機分組，其余予以剔除。分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、通心絡(luò)大劑量組(TXLH)、中劑量組(TXL-M)、小劑量組(TXL-L)、尼莫地平組(Nim)。其中假手術(shù)組和模型組以等體積的生理鹽水灌胃，通心絡(luò)大、中、小劑量組相當于臨床用量的16、8、4 倍，分別以 1.6、0.8、0.4 g·kg－1·d－1灌胃，即 2.4、1.2、0.6 g(生藥)·kg－1·d－1灌胃，尼莫地平組以10 mg·kg－1·d－1，1 次/d 灌胃。各組于給藥14 d后每組處死8只動物進行檢測。

Fig 1 Effects of Tongxinluo on microvascular density CD31in cerebral cortex ischemia area(×400)

1.6觀察指標及檢測方法

1.6.1大腦皮層微血管密度觀察大鼠心臟灌注固定后立即取腦，置于4%多聚甲醛固定48h后，石蠟包埋，于視交叉前緣開始作8 μm厚冠狀切片。SP法CD31免疫組化染色，DAB顯色。

1.6.2血管新生相關(guān)因子檢測

1.6.2.1血清 NO、VEGF檢測 常規(guī)分離血清，ELISA放射免疫方法檢測VEGF含量;硝酸還原酶法檢測NO。實驗操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6.2.2腦組織中VEGF表達的檢測 大鼠心臟灌注固定后立即取腦，置于4%多聚甲醛固定48h后，石蠟包埋，于視交叉前緣開始作8 μm厚冠狀切片。SP法VEGF免疫組化染色，DAB顯色。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，進行正態(tài)性檢驗，如正態(tài)分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，若方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗行兩兩比較;如不符合正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。

2 結(jié)果

2.1通心絡(luò)對腦缺血大鼠皮層微血管密度的影響

CD31蛋白陽性表現(xiàn)為棕黃色染色，主要在大腦缺血皮層區(qū)內(nèi)皮細胞、單核細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達。正常腦組織中有少數(shù)散在分布，模型組蛋白表達增強，通心絡(luò)大、中劑量組、尼莫地平組CD31蛋白陽性分布密集且著色明顯，均強于模型組，其中以通心絡(luò)大劑量組為優(yōu)。結(jié)果見Fig 1。

2.2血清NO，VEGF水平檢測結(jié)果與模型組比較，通心絡(luò)大劑量組、通心絡(luò)中劑量組大鼠血清NO水平明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，且通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)中劑量組(P＜0.05);通心絡(luò)大劑量組與通心絡(luò)小劑量組、尼莫地平組比較NO水平明顯提高(P＜0.01)。與模型組比較，通心絡(luò)大劑量組大鼠血清VEGF水平明顯提高(P＜0.01)，通心絡(luò)大劑量組優(yōu)于通心絡(luò)小劑量組和尼莫地平組(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見 Tab 1。

2.3腦組織VEGF蛋白表達結(jié)果VEGF蛋白在腦組織皮層區(qū)神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞均陽性表達。正常腦組織僅有少量表達，與模型組相比，通心絡(luò)大劑量組表達明顯加強，其余各用藥組雖然表達有所加強，但差異無顯著性。結(jié)果見Fig 2。

Fig 2 Effects of Tongxinluo on protein expression of VEGF in cerebral cortex ischemia area(×400)

Tab 1 NO/VEGF content of ischemic stroke rats in serum(±s，n=6)

Tab 1 NO/VEGF content of ischemic stroke rats in serum(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs TXL-L group;◆◆P ＜0.01 vs Nim group;△P ＜0.05 vs TXL-M group

Group NO/μmol·L －1 VEGF/ng·L －1 Sham 23.21 ±3.24 12.91 ±1.77 Model 21.24 ±3.93 14.22 ±1.00 TXL-H 48.07 ±4.20＊＊△##◆◆ 26.23 ±4.80＊＊#◆◆TXL-M 35.57 ±1.70* 19.73 ±1.75 TXL-L 29.76 ±3.41 16.95 ±0.98 Nim 27.70 ±3.21 13.60 ±1.63

3 討論

有研究表明，腦梗死患者腦組織中血管新生從梗死后3～4 d開始［4］，新形成的血管明顯改善缺血區(qū)血流灌注，促進腦缺血后的神經(jīng)功能恢復［5－6］，這說明促進缺血區(qū)微血管新生對保護神經(jīng)元具有重要作用，血管新生為腦梗死的治療開辟了一條再血管化的新途徑。

目前發(fā)現(xiàn)血管新生相關(guān)因子很多，其中包括VEGF、NO等成血管因子。VEGF是內(nèi)皮細胞特異性的促有絲分裂原和趨化因子，通過促進內(nèi)皮細胞增殖，加速新生血管的形成。NO是眾多血管生長因子的下游介質(zhì)，兩者相互協(xié)調(diào)，共同作用。最近Babaei等［7］研究表明來自內(nèi)皮的NO是Ang-1誘導血管生成所必需的，通過NO/cGMP路徑起作用。NO能夠延長內(nèi)皮細胞生命周期，增強內(nèi)皮細胞的增殖和遷移力，具有調(diào)節(jié)血管生成因子，刺激血管生成的作用。存在于腦組織中的NO、VEGF一旦受到缺血、缺氧或炎癥等刺激，開始大量合成并釋放入血，故血清NO、VEGF含量可以有效反映腦組織中NO、VEGF的合成狀態(tài)。應(yīng)用絡(luò)病理論指導血管病變防治研究研制出的創(chuàng)新藥物通心絡(luò)膠囊［8－13］可以保護腦組織毛細血管內(nèi)皮細胞，促進缺血性腦卒中毛細血管新生，改善腦微小循環(huán)障礙，減輕腦水腫，縮小腦梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損，抑制其凋亡，初步顯示出具有促進治療性血管新生的作用。本研究結(jié)果顯示通心絡(luò)能夠增加毛細血管密度，升高血清NO，VEGF水平，促進腦組織中VEGF表達，以上結(jié)果提示通心絡(luò)可能通過上調(diào)缺血腦組織中血管生長因子NO、VEGF表達，從而促進腦微血管新生，改善神經(jīng)功能恢復。

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