丁酸鈉通過維持乙?；胶飧纳婆两鹕∧Ｐ褪笳J知功能和情感障礙

宋玫香，張 巖，王 芳，王 虹，包金風

(徐州醫(yī)學院藥學院藥理學教研室，江蘇徐州 221004)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常發(fā)生于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，基本病理改變是中腦黑質致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元壞死、凋亡。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺合成過程中的限速酶，催化酪氨酸形成左旋多巴。黑質TH含量和活性降低導致的多巴胺匱乏是PD發(fā)病的主要原因。在PD腦組織中，TH表達含量明顯下降，表明多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目減少，TH已成為PD模型成功建立的指標之一。近年研究發(fā)現(xiàn)PD患者除運動協(xié)調功能受到損害，其認知和情感等也受到影響，如記憶力減退和抑郁癥的發(fā)生。1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)具有較強脂溶性，易通過血腦屏障，選擇性濃集于黑質，在單胺氧化酶B作用下，轉化為結構與多巴胺類似但有毒性的 1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methy1-4-phenyl pyridinium ion，MPP+)，進入多巴胺能神經(jīng)末梢和胞體，產(chǎn)生氧自由基，導致多巴胺能神經(jīng)元死亡，可利用MPTP在靈長類動物身上復制出PD動物模型。

疾病的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程，是環(huán)境與遺傳交互作用的結果，如PD和孤獨癥的發(fā)生等都與環(huán)境因素密不可分。表觀遺傳學是疾病發(fā)生發(fā)展過程中基因和環(huán)境相互作用的橋梁，是一種不依賴DNA序列改變的可逆的基因表達調控，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼的RNA表達等。組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學調節(jié)中研究最早的翻譯后修飾，與基因活化關系密切。組蛋白乙酰化水平是由組蛋白乙?；?histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同決定，二者之間的動態(tài)平衡調控著組蛋白的乙酰化/去乙?；癄顟B(tài)，控制著基因轉錄的啟動或關閉。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)靶向作用于 HDAC，主要通過抑制HDAC的活性使組蛋白乙?；潭壬撸鹑旧|重組，DNA轉錄活化或抑制。臨床前的實驗表明HDACi對于創(chuàng)傷性腦外傷和缺血損傷模型具有神經(jīng)保護和促進神經(jīng)發(fā)生的作用［1］，在創(chuàng)傷性腦外傷和神經(jīng)退行性疾病的鼠中HDACi具有保持學習和記憶［2］、增強神經(jīng)分化和突觸可塑性以及抗抑郁功能。但有關HDACi對PD模型鼠學習記憶及情感等方面的研究未見報道。丁酸鈉是一種四碳短鏈脂肪酸，通過抑制HDAC的活性，引起組蛋白超乙酰化，是HDAC的抑制劑。因此本研究利用MPTP建立PD小鼠模型，應用行為學及分子生物學實驗方法研究丁酸鈉對PD模型鼠認知功能和情感障礙的影響及可能作用機制。

1 材料

1.1實驗動物C57BL/6J小鼠，♂，6～8周齡，體質量(20±2)g，實驗分為4組:對照組、MPTP組、丁酸鈉組、MPTP+丁酸鈉組，n=10。動物自由攝食飲水，室溫25℃，適應環(huán)境1周。實驗動物由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2藥物配制及造模方法MPTP用無菌生理鹽水溶解，配制藥物濃度為2 g·L－1，制造急性PD模型，腹腔注射 MPTP 20 mg·kg－1，1日4 次，每次間隔2 h;丁酸鈉用無菌生理鹽水溶解，配制濃度為0.08 g·ml－1，腹腔注射丁酸鈉 0.8 g·kg－1。對照組腹腔注射等體積無菌生理鹽水。

1.3試劑與儀器MPTP和丁酸鈉由Sigma公司提供。RIPA裂解液和BCA蛋白濃度定量試劑盒由碧云天生物技術公司提供;TRIzol總RNA提取試劑盒，TIANScript cDNA第1鏈合成試劑盒，2×Taq PCRMasterMix試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。TH抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;HDAC1抗體購自Bioworld Technology，HDAC1引物由上海生工生物工程有限公司合成。

5417R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);EL104電子天平(梅特勒－托利多上海有限公司);－70℃冰箱(美國Forma公司);SZ93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);微波爐(廣東美的集團股份有限公司);PE9600PCR反應儀(美國PE公司);EPS300天能電泳儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1懸尾實驗將小鼠尾巴用醫(yī)用膠帶在距離尾尖1～1.5 cm處牢牢的固定在光滑的金屬表面，距離地面30 cm，用一個白色有機玻璃盒將小鼠與周圍環(huán)境隔開，防止小鼠視覺分散［3］。整個實驗由經(jīng)驗豐富且對實驗目的不明確的研究人員操作完成，記錄6 min內小鼠的活動狀態(tài)，并計算后4 min內小鼠的不動時間。

2.2Morris水迷宮實驗在特定的時間段(8∶00∶00～15∶00∶00)進行，藥物給予1 h后開始實驗。水溫(22±2)℃，水池周圍的物品位置固定不變。圓形水池(直徑100 cm，高40 cm)被穿過圓心的兩條虛擬的垂直直徑劃分為4個象限，平臺(直徑12 cm，高20 cm)位于水池中的任意1個象限，平臺低于水面1 cm，水中加入脫脂奶粉。將小鼠面向池壁入水，系統(tǒng)跟蹤記錄，小鼠到達平臺并在臺上停留5 s視為上臺成功;若60 s內小鼠未能找到平臺，應將其輕輕引上平臺并停留10 s作為強化記憶。在d 5將平臺撤除，所有小鼠自同一象限入水，自由游泳60 s，記錄小鼠60 s內在虛擬平臺所在象限(即目標象限)游泳時間占總時間的百分比，作為小鼠記憶能力的指標。

2.3Western blot檢測TH、HDAC1蛋白表達小鼠麻醉后迅速斷頭取腦，加入RIPA裂解液(含有體積分數(shù)為0.01的蛋白酶抑制劑)，冰水中超聲破碎，4 ℃ 12 000 r·min－1，離心3 ～5 min，取上清，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品在沸水中變性。配制體積分數(shù)0.10的SDS-PAGE分離膠，上樣，100 V 恒壓電泳，350 mA，80 min轉移至PVDF膜，用含質量分數(shù)為0.05 BSA的TBST室溫封閉2 h，分別加入一抗 anti-TH(1∶200)、anti-HDAC1(1∶500)4℃孵育過夜，洗膜，堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，堿性磷酸酶標記的顯色液顯色，掃描。用Image J圖像分析軟件計算每組蛋白條帶的光密度值，對目的蛋白條帶與同一樣品的βactin的光密度的比值進行比較。

2.4RT-PCR檢測HDAC1表達

2.4.1RNA提取取適量冰凍組織置于1.5 ml Eppendorf管中，加入1 ml TRIzol試劑，勻漿，室溫放置5 min，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4 ℃，12 000 r·min－1離心10 ～15 min，將上層水相轉移到新的Eppendorf管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置 20～30 min，4 ℃，12 000 r·min－1離心10 min，棄上清，加入1 ml體積分數(shù)為0.75 的乙醇，4 ℃，5 000 r·min－1離心 5 min，棄掉液體，沉淀室溫晾干，加入30 μl ddH2O，反復吹打，混勻，充分溶解RNA。

2.4.2反轉錄和PCR擴增取5 μg總 RNA，加入2 μl oligo(dT)15，2 μl dNTP，補 RNase-free ddH2O定容至14.5 μl。70℃ 5 min后迅速置冰上2 min，加入 4 μl 5 × First-Stand Buffer，0.5 μl RNase，1 μl TIANScript M-MLV，混勻，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。用RNase-free ddH2O將反應體系稀釋到50 μl，取4 μl上述稀釋后的反應體系，分別加入0.5 μl目的基因或內參基因的上下游引物(HDAC1上游引物5'-ATCCCTAATGAGCTGCCCTACA-3'，HDAC1 下游引物5'-ATGGAGAAGATGGGGCTGCAGA-3';GAPDH上游引物 5'-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3'，GAPDH下游引物5'-GCCATGTAGGCCATGAGGTC-3')，加入 12.5 μl 2 ×Taq PCR Mister Mix，加 7.5 μl RNase-free ddH2O，94℃預變性4 min;94℃ 變性30 s，58 ℃復性 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 個循環(huán);72 ℃延伸4 min后保存于4℃。取5 μl PCR產(chǎn)物進行質量濃度為20 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，取膠置于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和分析。根據(jù)積分吸光度值(IA)對比分析條帶的強弱，以HDAC1的IA與GAPDH的IA比值表示HDAC1 mRNA的相對表達水平。

2.5統(tǒng)計學處理應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。

3 結果

3.1丁酸鈉對PD模型鼠認知功能和情感障礙的影響

3.1.1懸尾實驗與對照組比較，MPTP組小鼠的不動時間明顯延長，表明MPTP模型鼠具有明顯的抑郁癥狀;MPTP+丁酸鈉組較MPTP組小鼠不動時間明顯縮短，表明丁酸鈉能夠明顯改善PD模型鼠的抑郁癥狀。見Fig 1。

Fig 1 The immobile time of each group in tail suspension test

3.1.2Morris水迷宮實驗與對照組相比，MPTP組小鼠尋找平臺的潛伏期延長(P＜0.05)，在目標象限游泳時間所占的百分比降低(P＜0.05)，MPTP組小鼠的學習記憶能力明顯降低;丁酸鈉組與對照組相比，小鼠尋找平臺的潛伏期有所增加，在目標象限游泳時間所占的百分比有所減少，但這種差異并沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，丁酸鈉對小鼠的學習記憶能力可能產(chǎn)生一定的損害作用;MPTP+丁酸鈉組較MPTP組小鼠尋找平臺的潛伏期縮短且在目標象限游泳時間所占的百分比增加(P＜0.05)，表明丁酸鈉能夠明顯提高PD模型鼠的學習記憶能力。見 Fig 2、3。

3.2丁酸鈉對PD模型鼠TH蛋白表達的影響與對照組相比，MPTP組、丁酸鈉組小鼠腦組織TH表達明顯降低(P＜0.05);MPTP+丁酸鈉組較MPTP組小鼠腦組織TH表達明顯升高(P＜0.01)，表明丁酸鈉能夠明顯保護PD模型鼠多巴胺能神經(jīng)元。見Fig 4A，4B。

Fig 2 Comparison of the escape latency period(time to platform)for 4 consecutive days in Morris Water Maze test

Fig 3 The percentage time in the target quadrant indicates the degree of memory consolidation in the fifth day of the Morris Water Maze test

3.3丁酸鈉對PD模型鼠HDAC1蛋白表達和mRNA水平的影響Western blot和RT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，MPTP組和丁酸鈉組小鼠腦組織中HDAC1蛋白表達和mRNA水平明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);MPTP+丁酸鈉組與MPTP組相比HDAC1蛋白表達和mRNA水平升高(P＜0.05)，結果表明PD模型鼠組蛋白乙?；瘍确€(wěn)態(tài)發(fā)生失調，丁酸鈉能夠修復和維持PD模型鼠的組蛋白乙?；钠胶鉅顟B(tài)。見Tab 1。

4 討論

Tab 1 Influence of sodium butyrate on HDAC1 mRNA level in brain tissues of acute PD model mice(±s，n=3)

Tab 1 Influence of sodium butyrate on HDAC1 mRNA level in brain tissues of acute PD model mice(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs MPTP model group

Group HDAC1/β-actin Control 0.360 ±0.011 MPTP model 0.257 ±0.010＊＊Sodium butyrate 0.332 ±0.016*MPTP plus sodium butyrate 0.279 ±0.011#

Fig 4 The protein expression of TH and HDAC1 in different groups assayed by Western blot

研究發(fā)現(xiàn)，50%的早期PD患者伴有輕度認知障礙，主要包括視空間障礙、記憶改變、智力改變以及情感障礙等。視空間障礙是PD最常見的認知障礙，患者早期即有視覺空間記憶損害，且主要影響相對空間工作記憶;情感障礙主要包括抑郁、焦慮和淡漠，一般抑郁的發(fā)生率為40% ～45%，程度為輕到中度，到晚期幾乎100%病人都伴有抑郁癥狀，抑郁是PD病人睡眠障礙、日常生活能力和生活質量下降的主要危險因素［4］。多巴胺是腦內的主要的神經(jīng)遞質之一，在運動、動機、學習記憶和情感等方面起著重要的作用。研究表明［5］，多巴胺能神經(jīng)元能夠參與調控與果蠅記憶有關的神經(jīng)環(huán)路。中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺通路的失調可引起認知和情感障礙及精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病。TH是多巴胺合成過程中的限速酶，TH表達水平的高低可以反映出多巴胺神經(jīng)元的生存與丟失。研究顯示［6］MPTP模型組小鼠黑質紋狀體內TH水平降低，小鼠紋狀體內多巴胺水平也降低，表明PD模型成功建立。本研究采用C57BL/6J小鼠腹腔注射MPTP制造急性PD模型，MPTP模型組與對照組比較，TH蛋白表達明顯減少表明MPTP模型組多巴胺神經(jīng)元損傷或死亡;小鼠尋找平臺的潛伏期明顯延長，在目標象限所占時間百分比明顯降低，懸尾實驗中小鼠的不動時間明顯延長，表明MPTP組小鼠的學習、記憶能力降低，并出現(xiàn)抑郁樣行為。

組蛋白乙?；Ш庖殉蔀樯窠?jīng)退行性疾病以及一些與年齡有關的記憶障礙疾病的主要發(fā)病機制。研究表明［7］APPPS1-21轉基因鼠前腦區(qū)淀粉樣蛋白病變與組蛋白乙?；黠@失調緊密相關，在阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病早期，經(jīng)HDACi丁酸鈉長期處理能夠提高APPPS1-21鼠的相關記憶功能，記憶能力的恢復與組蛋白乙?；降纳咭约芭c學習能力有關的基因表達的增加緊密相關。對Tg2576 AD鼠每天注射4-苯基(一種HDACi)后，在不影響Aβ水平的前提下能夠使海馬區(qū)tau蛋白磷酸化恢復正常，從而逆轉其空間記憶障礙［8］。對APP23轉基因AD鼠，每天腹腔注射低劑量的丙戊酸(一種HDACi)，能夠明顯減少Aβ斑塊數(shù)，且早期治療能夠改善其記憶障礙［9］。組蛋白的乙酰化/去乙酰化修飾在抑郁癥發(fā)病機制和抗抑郁治療的過程中也起到重要作用。三環(huán)類抗抑郁藥物丙咪嗪能夠改善抑郁小鼠模型中長期的應激刺激造成的行為學損害，這種抗抑郁作用能夠被海馬組蛋白去乙?；饔米钄?。丁酸鈉能夠提高小鼠海馬及前額葉腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達，長期應用電休克治療抑郁癥能夠使大鼠海馬BDNF啟動子上組蛋白的乙酰化增加，BDNF表達上調，BDNF在學習、記憶以及高級認知功能方面有重要的作用［10－11］。PD模型鼠經(jīng)過HDACi丙戊酸、丁酸鈉或曲古菌素處理后，HDACi能夠明顯減少由MPP+誘導的TH陽性神經(jīng)元的死亡［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，MPTP+丁酸鈉組與MPTP組相比，TH蛋白表達增加，在Morris水迷宮實驗中，前者尋找平臺的潛伏期明顯縮短且在目標象限所占時間百分比明顯增加，懸尾實驗中，前者不動時間較后者明顯縮短，表明丁酸鈉能夠保護多巴胺神經(jīng)元，明顯提高PD模型鼠的學習記憶能力，改善PD模型鼠抑郁癥狀。

本研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉組與對照組相比，TH蛋白表達明顯減少，小鼠尋找平臺的潛伏期有所延長且在目標象限所占時間百分比有所降低，小鼠的不動時間縮短。我們前期研究結果顯示，體外培養(yǎng)的新生小鼠神經(jīng)元，不同濃度的丁酸鈉(1.25、2.5、5、10、20 mmol·L－1)能夠誘導神經(jīng)元凋亡，并且隨著丁酸鈉劑量的增加，其誘導神經(jīng)元凋亡的作用明顯增強，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，這個結果與文獻報道的［13］HDACi能夠誘導培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡的研究結果一致。表明在正常情況下丁酸鈉對機體產(chǎn)生一定的損害作用。

在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中，HAT含量下降，乙?；瘍确€(wěn)態(tài)平衡打破。HDACi靶向作用于HDAC，主要通過抑制HDAC的活性使組蛋白乙?；潭壬?。HDACi能夠提高組蛋白H3及H4的乙酰化水平，促進腦退行性病變動物恢復長時記憶和形成新記憶，鞏固長時程增強，提高實驗動物的學習記憶能力，改善神經(jīng)退行性病變模型的癥狀。在亨廷頓病果蠅模型的研究中發(fā)現(xiàn)，特異性的抑制HDAC的活性能夠阻滯疾病的進程［14］。苯丁酸鈉是一種HDACi，能夠糾正肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)小鼠異?；虻霓D錄，與利魯唑合用時，能夠明顯延長G93A轉基因ALS小鼠的生存，改善臨床和神經(jīng)病理學表型［15］。本研究中，Western blot和RT-PCR實驗結果顯示，MPTP組、丁酸鈉組與對照組相比，HDAC1的表達水平明顯降低，MPTP+丁酸鈉組HDAC1的表達較MPTP組明顯升高，表明PD模型鼠組蛋白乙?；瘍确€(wěn)態(tài)發(fā)生失調，丁酸鈉能夠修復和維持PD模型鼠的組蛋白乙酰化的平衡狀態(tài)。

綜合上述研究結果，我們推測丁酸鈉能夠增加PD模型鼠TH的表達，保護多巴胺能神經(jīng)元，從而改善PD模型鼠認知功能和情感障礙，這種作用機制可能是通過修復和維持組蛋白乙?；钠胶鉅顟B(tài)來完成。因此詳細闡明丁酸鈉對PD模型鼠認知功能和情感障礙改善的具體機制，有望為未來中樞神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的理論依據(jù)和方法，也為未來新一類治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的研究和開發(fā)提供新的靶點。

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