鹽酸關(guān)附甲素對(duì)大鼠血管舒縮功能的影響及其機(jī)制

陸家鳳，可 燕，蔣嘉燁，栗 源，李曉軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

關(guān)白附為毛茛科植物黃花烏頭〔Aconitum coreanum(Levl.)Raip.〕的塊根，《名醫(yī)別錄》有記載“關(guān)白附辛溫發(fā)散，可通經(jīng)脈”;既可作為溫里藥散寒止痛，又可祛風(fēng)痰治療中風(fēng)［1］。中風(fēng)的原因之一是腦血管收縮或痙攣導(dǎo)致血壓升高、血管張力增加變脆，最終腦出血［2］，而溫里藥普遍有擴(kuò)張心腦血管，增加血流量，改善微循環(huán)的功效［3］。關(guān)附甲素(guanfu base-A，GFA)是關(guān)白附中的主要活性單體化合物［4］，早在20世紀(jì)80年代就有學(xué)者就其對(duì)血壓的影響做過(guò)藥理研究，發(fā)現(xiàn)大鼠頸外靜脈注射GFA 30 mg·kg－1后血壓出現(xiàn)下降［5］。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察GFA對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈血管張力的影響，探討其是否有擴(kuò)血管功效，并分析可能的機(jī)制。

1 材料

1.1試劑和儀器關(guān)附甲素，批號(hào):100665-200901，中國(guó)藥品生物制品檢定所;苯腎上腺素(phenylephrine，PE)，批號(hào):P6126-5G，Sigma 公司;乙酰膽堿(ACh)，批號(hào):A7000-5G，Sigma公司;毛喉素(forskolin，F(xiàn)SK)，批號(hào):F6886，Sigma 公司;左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，批號(hào):53-86-1，Adamas Reagent;亞甲藍(lán)(methylene blue)，批號(hào):61-73-4，Adamas Reagent;吲哚美辛(indomethacin)，批號(hào):51298-62-5，Adamas Reagent。Krebs-Henseleit(K-H)液(1 mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，CaCl22.5，Glucose 11，pH=7.4);無(wú)鈣液(1 mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，Glucose 11，pH=7.4):Powerlab八通道多功能生理記錄儀(AD Instruments公司)。

1.2動(dòng)物SD大鼠，(250±20)g，♂，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2 方法

2.1血管環(huán)的制備迅速取出胸主動(dòng)脈置于4℃、含95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和的K-H液中，剝除周?chē)Y(jié)締組織后制成3～4 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于4 ml K-H液的浴槽內(nèi)，37℃恒溫，并持續(xù)通入95%O2+5%CO2的混合氣體。每個(gè)血管環(huán)給予2.0 g拉力，每15 min更換K-H液1次，平衡90 min。以60 mmol·L－1的KCl預(yù)收縮兩次，以誘發(fā)最大收縮度，用K-H液洗脫拉力穩(wěn)定后，加入1 μmol·L－1的 PE 收縮，待拉力達(dá)坪值后，加入10－5mol·L－1ACh，若血管舒張達(dá) 80% 以上，可認(rèn)為內(nèi)皮完整;制備去內(nèi)皮血管環(huán)時(shí)，可用棉簽輕拭血管環(huán)內(nèi)表面，當(dāng)加入10－5mol·L－1ACh后血管舒張度在20%以下為內(nèi)皮被去除［6］。

2.2累積濃度的GFA對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)及KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響將內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮的胸主動(dòng)脈隨機(jī)分為:①內(nèi)皮完整GFA組(GFA Endo+);② 內(nèi)皮完整對(duì)照組(Control Endo+);③ 去內(nèi)皮GFA組(GFA Endo－);④ 去內(nèi)皮對(duì)照組(Control Endo－)。以不同累積濃度的GFA作用于基礎(chǔ)狀態(tài)及KCl(60 mmol·L－1)預(yù)刺激收縮的血管環(huán)，實(shí)驗(yàn)組(n=6)采用累積加藥法，每2 min加GFA 1次，使浴槽中的 GFA 終濃度分別達(dá) 10－8、10－7、10－6、10－5、10－4mol·L－1，觀察 GFA 對(duì)兩種狀態(tài)下血管舒張度的影響，對(duì)照組(n=6)以蒸餾水代替GFA累積加入。

2.3累積濃度的GFA對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)的影響分組及加藥方法同“2.2”。實(shí)驗(yàn)組(n=6)以不同累積濃度的GFA作用于PE(10－6mol·L－1)預(yù)收縮的血管環(huán)，觀察GFA對(duì)血管環(huán)的作用，對(duì)照組(n=6)以蒸餾水代替GFA累積加入。

2.4GFA對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的去內(nèi)皮血管環(huán)的作用實(shí)驗(yàn)組(n=6)將血管去內(nèi)皮后在無(wú)鈣液中穩(wěn)定30 min，加 GFA(10－4mol·L－1)共育 15 min 后，再加PE(1 μmol·L－1)收縮血管，觀察 GFA 的作用，對(duì)照組(n=6)以K-H液代替GFA孵育去內(nèi)皮血管環(huán)。

2.5GFA對(duì)L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛預(yù)處理的PE收縮血管效應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)組(n=6)分別用L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛(濃度均為0.1 mmol·L－1)孵育內(nèi)皮完整的血管環(huán)20 min，以PE預(yù)收縮，觀察累積濃度GFA的血管舒張作用;對(duì)照組(n=6)以蒸餾水替代GFA累積加入。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1累積濃度的GFA對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)及KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響見(jiàn)Fig 1。累積濃度的GFA(10－8～10－4mol·L－1)對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)和KCl預(yù)收縮的內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮的離體動(dòng)脈環(huán)均無(wú)明顯影響(P＞0.05)。

3.2累積濃度的GFA對(duì)PE預(yù)收縮血管環(huán)的影響見(jiàn) Fig 2。累積濃度的 GFA(10－8～ 10－4mol·L－1)對(duì) PE(10－6mol·L－1)預(yù)收縮的內(nèi)皮完整的胸主動(dòng)脈有濃度依賴(lài)性舒張作用，最大舒張率可達(dá)33.05%;各濃度的GFA對(duì)去內(nèi)皮的胸主動(dòng)脈無(wú)舒張作用，與PE預(yù)收縮最大時(shí)的張力相比，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings in basis tension(A)and precontracted by KCl(B)

Fig 2 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings precontracted by PE

3.3L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛對(duì)GFA舒張血管作用的影響見(jiàn)Fig 3。與對(duì)照組相比，分別加入L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛處理后GFA對(duì)PE預(yù)收縮的血管產(chǎn)生舒張作用明顯減弱。其中L-NAME組、吲哚美辛組與GFA組比較在10－7～10－4mol·L－1時(shí)差異有顯著性(P＜ 0.01)，而在 10－8mol·L－1時(shí)與GFA比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05);亞甲藍(lán)組則在 GFA 10－8～10－4mol·L－1時(shí)差異均有顯著性(P＜0.01)。

Fig 3 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings after incubated with L-NAME，methylene blue or indomethacin

3.4 GFA對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的去內(nèi)皮血管環(huán)的影響

見(jiàn) Fig 4。GFA(10－4mol·L－1)及無(wú)鈣液預(yù)處理后，血管對(duì)PE的收縮反應(yīng)明顯降低(P＜0.01)。

Fig 4 Effect of GFA on endothelium-denuded rings preincubated with Ca2+free medium

4 討論

血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及功能正常是形成健康血管的基礎(chǔ)。非內(nèi)皮依賴(lài)性途徑下的血管平滑肌的舒縮主要與細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流和內(nèi)鈣離子的釋放從而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加有關(guān)［7］。雖然KCl和PE均通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度而使血管收縮，但機(jī)制卻不相同。KCl主要通過(guò)開(kāi)放電壓門(mén)控鈣離子通道，使細(xì)胞外鈣內(nèi)流引起血管平滑肌細(xì)胞超極化，從而使血管收縮［8］。而PE通過(guò)作用于受體操作性鈣通道(ROC)和通過(guò)激活磷脂酶C，后者產(chǎn)生甘油二酯(DG)和三磷酸肌醇(IP3)［9］，它們共同作用于鈣通道使肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放［10］，而使血管平滑肌收縮。研究結(jié)果顯示，GFA可以劑量依賴(lài)性地抑制PE誘導(dǎo)的內(nèi)皮完整的血管收縮而對(duì)KCl誘導(dǎo)的內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管收縮均無(wú)效。為了進(jìn)一步確定GFA舒血管的作用的機(jī)制是否與抑制內(nèi)鈣釋放有關(guān)，又使用無(wú)鈣液預(yù)處理去內(nèi)皮的胸主動(dòng)脈。發(fā)現(xiàn)血管環(huán)經(jīng)過(guò)無(wú)鈣液及GFA共育后，PE引起的收縮反應(yīng)明顯受到抑制，提示GFA對(duì)非內(nèi)皮途徑的血管舒張作用可能與抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放有關(guān)，而與門(mén)控鈣離子通道引起外鈣內(nèi)流無(wú)關(guān)。

另一種血管擴(kuò)張途徑為內(nèi)皮依賴(lài)性舒張。在大血管中內(nèi)皮細(xì)胞主要通過(guò)分泌血管舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)而擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞達(dá)到血管舒張作用［11］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GFA引起血管舒張是否具有內(nèi)皮依賴(lài)性。本實(shí)驗(yàn)分別選用內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GFA對(duì)PE誘導(dǎo)的內(nèi)皮完整血管有明顯的舒張作用(P＜0.01)，而去內(nèi)皮的血管的舒張作用不明顯(P＞0.05)，提示內(nèi)皮系統(tǒng)途徑可能參與了GFA的舒張血管作用。NO是由血管內(nèi)皮中的一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸而來(lái)，NO作為信號(hào)分子激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)進(jìn)而產(chǎn)生環(huán)磷鳥(niǎo)苷酸(cGMP)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，從而使血管舒張［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用非選擇性NOS抑制劑L-NAME或鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)均可明顯抑制GFA的舒張血管作用，說(shuō)明擴(kuò)血管機(jī)制可能是通過(guò)NO－GC－cGMP途徑介導(dǎo)的，是內(nèi)皮依賴(lài)性的。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還可在花生四烯酸限速酶環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)的作用下，把花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N內(nèi)皮舒張因子前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)，它可作用于血管平滑肌產(chǎn)生環(huán)磷腺苷酸(cAMP)而使血管舒張［13－14］。實(shí)驗(yàn)證明，在使用非特異性環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛孵育后，GFA的血管舒張功能明顯降低，提示GFA的擴(kuò)血管作用也可能由前列環(huán)素介導(dǎo)，環(huán)氧合酶途徑亦參與了GFA擴(kuò)血管作用。

心率的加快可增加血流對(duì)血管的剪切力，直接對(duì)內(nèi)皮造成損傷;同時(shí)也能加速新陳代謝及心肌耗氧量、產(chǎn)生自由基，間接損傷血管內(nèi)皮［15］。GFA是從中藥關(guān)白附中提取分離的二帖類(lèi)生物堿，其靜脈注射液是我國(guó)獨(dú)立研制的一類(lèi)新藥，可通過(guò)終止房顫、陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速，明顯延長(zhǎng)心房有效不應(yīng)期而具有良好的抗心律失常作用［16－17］。雖然關(guān)白附是否可通過(guò)抗心律失常間接保護(hù)血管內(nèi)皮有待進(jìn)一步的論證;但本次研究證明了關(guān)白附可直接作用于血管，產(chǎn)生舒張作用。具體機(jī)制有非內(nèi)皮依賴(lài)性舒張機(jī)制:抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放，及部分內(nèi)皮依賴(lài)性舒張機(jī)制:①參與NO－GC－cGMP途徑，激活eNOS或鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，增加NO生成量;②激活環(huán)氧合酶，增加PGI2含量。該發(fā)現(xiàn)對(duì)GFA在心血管系統(tǒng)藥理作用的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及心血管疾病的合理臨床用藥指導(dǎo)有重要意義。

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