低分子量肝素聯(lián)合吉西他濱對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

趙素容，劉 浩，吳成柱，王 秀，梁 穎，陳 超，蔣志文

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233030)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升，并且發(fā)病年齡趨于年輕化。目前，含蒽環(huán)類和紫杉類藥物的化療方案是治療乳腺癌的首選方案，盡管療效顯著，但易發(fā)生耐藥，一旦出現(xiàn)耐藥，臨床治療就相當(dāng)困難。吉西他濱(gemcitabine，GEM)是一種嘧啶類抗代謝藥，主要?dú)鸖期細(xì)胞，也可以阻止細(xì)胞由G1期向S期進(jìn)展。GEM對(duì)蒽環(huán)類和紫杉類藥物耐藥的乳腺癌有較高的療效，且耐受性較好［1］。是目前治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、晚期乳腺癌和復(fù)發(fā)性乳腺癌的主要藥物之一。研究表明，肝素及其類似物具有延長(zhǎng)腫瘤患者生存期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲、遷移以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等生物活性，其抗腫瘤作用日益受到重視［2－5］。本實(shí)驗(yàn)研究低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)對(duì)GEM抗腫瘤作用的影響，并分析可能的作用機(jī)制，以期為乳腺癌的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435由蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室保存。培養(yǎng)條件:含10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.2主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生牛血清:Gibco公司;低分子量肝素鈉注射液(克賽，平均分子質(zhì)量為3 500～5 500 u):Sanofi-Aventis公司;注射用鹽酸吉西他濱:江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;Transwell小室:Costar公司;Matrigel基質(zhì)蛋白:BD公司;MMP-9抗體、β-actin抗體:武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG:中杉金橋生物技術(shù)有限公司;人乙酰肝素酶ELISA試劑盒:R＆D公司。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為3×107·L－1，接種于96孔板中，每孔200 μl，于5%CO2飽和濕度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，不同濃度 LMWH(6.25 ×104、12.5 ×104、25 ×104、50×104、100 ×104IU·L－1)、GEM(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L－1)以及 60 ×104IU·L－1LMWH 聯(lián)合GEM(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L－1)處理，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h 后每孔加入 10 μl濃度為 5 g·L－1的MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，37℃孵育30 min，微量振蕩器振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度(D)值，計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組D570nm/對(duì)照組D570nm×100%，繪制劑量效應(yīng)曲線，采用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌槍頭沿孔中心劃出一道“傷痕”，PBS沖洗干凈，每孔加入含2%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基500 μl。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和藥物處理組(30 ×104IU·L－1LMWH 組、2.5 mg·L－1GEM 組、30 ×104IU·L－1LMWH 聯(lián)合2.5 mg·L－1GEM組)。處理24 h后觀察細(xì)胞向中間遷移的情況并拍照。

1.5Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化離心，用含30×104IU·L－1LMWH、2.5 mg·L－1GEM、30 ×104IU·L－1LMWH聯(lián)合2.5 mg·L－1GEM的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至5×108·L－1，每個(gè) Transwell小室中加入100 μl，下室每孔加入含5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基600 μl，培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去小室上層未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，各取5個(gè)400×視野顯微鏡下觀察拍照。遷移抑制率/%=(1－實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):每個(gè)Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜鋪50 μl Matrigel基質(zhì)蛋白，藥物處理36 h，其余操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。侵襲抑制率/%=(1－實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6Western blot檢測(cè)MMP-9的蛋白表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至90%融合，換液加入含60×104IU·L－1LMWH、5 mg·L－1GEM、60 ×104IU·L－1LMWH 聯(lián)合5 mg·L－1GEM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。處理24 h后消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2次，每個(gè)處理加入70 μl預(yù)冷的蛋白裂解液［20 mmol·L－1Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1EGTA，1 mmol·L－1原礬酸鈉，1 mmol·L－1PMSF，體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100，2.5 mmol·L－1焦磷酸鈉，40 mmol·L－1β-甘油磷酸，10 mg·L－1的亮肽素、抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制劑］，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定各組蛋白濃度。每組取40 μg蛋白，10%SDS-PAGE 電泳(70 V，30 min;120 V，90 min);轉(zhuǎn)膜(50 V，120 min)至PVDF膜;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;一抗1∶200室溫孵育2 h;TPBS洗膜3次;二抗1∶2 000室溫孵育1 h;TPBS洗膜3次;ECL發(fā)光試劑盒顯影;Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.7ELISA法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液中HPA的表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞充分貼壁后換液加入含60×104IU·L－1LMWH、5 mg·L－1GEM、60 ×104IU·L－1LMWH 聯(lián)合 5 mg·L－1GEM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理24 h后收集上清，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組D450nm/對(duì)照組D450nm確定各組HPA的分泌情況。

Fig 1 Proliferation of breast cancer cells inhibited by GEM

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各組間比較用雙側(cè)Dunnettt檢驗(yàn)。

Fig 2 Inhibitory effect of LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM on the migration of breast cancer cells by wound healing assay

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖情況MTT結(jié)果顯示，不同濃度GEM 處理 MDA-MB-231、MDA-MB-435 細(xì)胞 24、48、72 h，對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，且具有時(shí)間和濃度依賴性。MDA-MB-231細(xì)胞作用48 h的IC50為4.2 mg·L－1，MDA-MB-435 細(xì)胞作用48 h 的 IC50為 5.6 mg·L－1(Fig 1)。但 LMWH 在6.25×104～100×104IU·L－1濃度范圍內(nèi)對(duì) MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞增殖的影響不明顯。與此同時(shí)，60×104IU·L－1LMWH 與不同濃度(0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L－1)GEM合用結(jié)果顯示，LMWH亦不能增強(qiáng)GEM對(duì)MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞增殖的抑制作用(數(shù)據(jù)未列出)。

2.2細(xì)胞遷移情況細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30×104IU·L－1LMWH、2.5 mg·L－1GEM 均可抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞的遷移，兩者合用后對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制作用更明顯(Fig 2)。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單用GEM時(shí)細(xì)胞的遷移抑制率分別為47.4%、52.9%;LMWH與GEM合用時(shí)細(xì)胞的遷移抑制率增加，分別為66.3%、76.5%，提示LMWH能增強(qiáng)GEM對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的抑制作用(Fig 3)。

2.3細(xì)胞侵襲情況Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LMWH、GEM以及LMWH與GEM合用均可明顯抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞對(duì)Matrigel基質(zhì)蛋白的破壞作用，單用GEM時(shí)對(duì)MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞的侵襲抑制率分別為37.8%、46.0%，LMWH與 GEM合用時(shí)分別為64.9%、71.4%，提示LMWH可增強(qiáng)GEM對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的抑制作用(Fig 4)。

2.4MMP-9的蛋白表達(dá)情況Western blot結(jié)果顯示，60 ×104IU·L－1LMWH、5 mg·L－1GEM 作用于MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞24 h后，MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)，合用時(shí)下調(diào)更加明顯(Fig 5)。

2.5HPA的表達(dá)情況LMWH與GEM均可抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞HPA的分泌，合用時(shí)抑制作用更強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig 6)。

Fig 3 Inhibitory effect of LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM on the migration of breast cancer cells by Transwell migration assay

Fig 4 Inhibitory effect of LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM on the invasion of breast cancer cells by Transwell invasion assay

Fig 5 Expression of MMP-9 in breast cancer cells after exposure to LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM for 24 h

3 討論

目前乳腺癌的治療以外科手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、基因治療、中醫(yī)中藥治療等多種手段為主，但效果多不甚理想，尤其是單一藥物治療，存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)且容易產(chǎn)生耐藥，聯(lián)合不同作用機(jī)制的藥物，提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物的療效、降低其毒副作用以及延緩耐藥性的產(chǎn)生，是腫瘤治療的一個(gè)重要策略［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察了LMWH聯(lián)合GEM對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及MMP-9和HPA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，LMWH具有增強(qiáng)GEM抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用，但對(duì)GEM的增殖抑制作用沒有明顯影響。

Fig 6 Expression of HPA in breast cancer cells after exposure to LMWH，GEM，and LMWH combined with GEM for 24 h

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移包括腫瘤生長(zhǎng)侵襲、細(xì)胞脫落進(jìn)入循環(huán)流動(dòng)、與脈管內(nèi)皮或組織基質(zhì)黏附、通過組織和間隙變形移動(dòng)、降解破壞細(xì)胞間質(zhì)和定植生長(zhǎng)等主要過程。侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性程度的重要生物學(xué)特性和影響腫瘤預(yù)后的主要因素，因此對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究對(duì)腫瘤治療方案的選擇和判斷預(yù)后具有重要的意義［7］。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，主要依靠蛋白水解酶的作用。MMPs是一類鋅離子依賴性蛋白酶，通過降解ECM中的絕大部分組分促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，其過表達(dá)與乳腺癌的高轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后相關(guān)［8］。MMPs也參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)因子的釋放和腫瘤血管生成［9］。MMP-9是其中的關(guān)鍵分子之一，在乳腺癌患者中的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)［10］。同時(shí)，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，HSPG)作為ECM的另一主要成分，其降解也是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。HPA是目前已知體內(nèi)唯一能夠降解HSPG的β-D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，可識(shí)別并降解HSPG的硫酸肝素(heparan sulfate，HS)側(cè)鏈，破壞由ECM組成的屏障結(jié)構(gòu)，并釋放結(jié)合在HS上的生長(zhǎng)因子(如 bFGF、PDGF、VEGF等)，從而刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［11］。HPA在正常組織中基本不表達(dá)，但在包括乳腺癌在內(nèi)的許多人類惡性腫瘤中高表達(dá)，可望成為理想的抗腫瘤靶點(diǎn)［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LMWH能增強(qiáng)GEM下調(diào)MMP-9和HPA的表達(dá)，可能是其增強(qiáng)GEM抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)證明了LMWH具有增強(qiáng)GEM抑制MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞侵襲和遷移的作用，二者聯(lián)合應(yīng)用在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面可能具有協(xié)同作用，具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［1］Dent S，Messersmith H，Trudeau M.Gemcitabine in the management of metastatic breast cancer:a systematic review［J］.Breast Cancer Res Treat，2008，108(3):319 －31.

［2］Phillips P G，Yalcin M，Cui H，et al.Increased tumor uptake of chemotherapeutics and improved chemoresponse by novel non-anticoagulant low molecular weight heparin［J］.Anticancer Res，2011，31(2):411－9.

［3］Ishida K，Wierzba MK，Teruya T，et al.Novel heparan sulfate mimetic compounds as antitumor agents［J］.Chem Biol，2004，11(3):367－77.

［4］Dredge K，Hammond E，Handley P，et al.PG545，a dual heparanase and angiogenesis inhibitor，induces potent anti-tumour and anti-metastatic efficacy in preclinical models［J］.Br J Cancer，2011，104(4):635 －42.

［5］Ritchie J P，Ramani V C，Ren Y，et al.SST0001，a chemically modified heparin，inhibits myeloma growth and angiogenesis via disruption of the heparanase/syndecan-1 axis［J］.Clin Cancer Res，2011，17(6):1382 －93.

［6］蘇 方，劉 浩，程 秀，等.塞來(lái)昔布聯(lián)合多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(5):632－8.

［6］Su F，Liu H，Cheng X，et al.Effects of celecoxib combined with doxorubicin on the proliferation and apoptosis of breast cancer cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):632 －8.

［7］吳 靜，雷艷麗，金 堅(jiān)，等.rhddADAM15蛋白抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(9):1218－23.

［7］Wu J，Lei Y L，Jin J，et al.Inhibitory effects and mechanism of rhddADAM15 on the growth of melanoma B16 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(9):1218 －23.

［8］Duffy M J，Maguire T M，Hill A，et al.Metalloproteinases:role in breast carcinogenesis，invasion and metastasis［J］.Breast Cancer Res，2000，2(4):252 －7.

［9］Freije J M，Balbín M，Pendás A M，et al.Matrix metalloproteinases and tumor progression［J］.Adv Exp Med Biol，2003，532:91－107.

［10］Incorvaia L，Badalamenti G，Rini G，et al.MMP-2，MMP-9 and activin A blood levels in patients with breast cancer or prostate cancer metastatic to the bone［J］.Anticancer Res，2007，27(3B):1519－25.

［11］Zcharia E，Jia J，Zhang X，et al.Newly generated heparanase knock-out mice unravel co-regulation of heparanase and matrix metalloproteinases［J］.PLoS One，2009，4(4):e5181.

［12］Barash U，Cohen-Kaplan V，Dowek I，et al.Proteoglycans in health and disease:new concepts for heparanase function in tumor progression and metastasis［J］.FEBS J，2010，277(19):3890 －903.