補體旁路激活導致內(nèi)皮細胞活化和損傷

孫黔云，李 敏，葉巧玲，李紅玲

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，2.貴州省人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，貴州貴陽 550002)

補體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體天然防御、免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用［1－2］。但補體的過度激活會引發(fā)炎癥和組織損傷［2－4］，尤其是補體替代途徑的過度激活在一系列疾病和病征的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色［5－6］。而補體引發(fā)炎癥和組織損傷的關(guān)鍵在于其激活后對血管內(nèi)皮細胞所產(chǎn)生的作用。以往報道的補體作用內(nèi)皮細胞相關(guān)研究多為關(guān)注單一補體活化成分影響臍靜脈內(nèi)皮細胞的作用，而對病理生理條件下補體激活產(chǎn)物作用和影響微血管內(nèi)皮細胞的研究報道極少。為進一步認識和理解補體過度激活對血管內(nèi)皮細胞的影響及在相關(guān)病理中的作用，為相關(guān)新藥的篩選和評價提供參考依據(jù)以及合適的細胞模型，本文報道了補體替代途徑的激活對人微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的活化和損傷作用。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內(nèi)皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養(yǎng)，DMEM細胞培養(yǎng)基和胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品;人 P-selectin、E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8測定ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;caspase-8螢光檢測試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品;健康人混合血清(normal human serum，NHS)由本實驗室健康志愿者獻血制備，分裝保存于－80℃，經(jīng)補體活性檢測后備用;滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)采用標準方法制備;眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)的制備和活力單位測定同已發(fā)表文獻［7］。其它試劑均為符合實驗要求的國產(chǎn)或進口試劑。

1.2主要儀器設(shè)備Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱和Revco超低溫冰箱(美國Thermo公司);Nikon TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);GloMax化學發(fā)光檢測儀(美國Promega公司);Bio-Rad 550酶標儀(美國 Bio-Rad公司)。5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);Elix純水系統(tǒng)和Milli Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3方法

1.3.1補體激活物的制備將NHS與CVF(6.5×104U·L－1)等體積混合，37℃水浴孵育 30 min，將孵育物(CVF-activated complement，以下簡稱CAC)分裝，凍存于 －80℃?zhèn)溆?。實驗中采?INHS與CVF的孵育混合物作為CAC的對照。

1.3.2補體激活誘導內(nèi)皮細胞表達P-selectin的作用

1.3.2.1量效作用測定 將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，加入含體積分數(shù)分別為5%、10%、20%、30%、40%CAC 的無血清DMEM 培養(yǎng)基200 μl，37℃ 培養(yǎng)20 min，取培養(yǎng)上清，2 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，按試劑盒推薦步驟進行P-selectin測定。

1.3.2.2時效作用測定 將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，37℃分別培養(yǎng) 5、10、20、30、60 min，取培養(yǎng)上清，2 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，測定 P-selectin。

1.3.3補體激活對HMEC表達E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的影響將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，37℃培養(yǎng)不同時間，取培養(yǎng)上清，按試劑盒推薦步驟進行E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8測定。

1.3.4補體激活對HMEC的損傷情況將HMEC細胞以4.5×103cells·well－1接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入含30%CAC的無血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，各組別分別培養(yǎng)不同時間，按試劑盒推薦步驟分別檢測細胞釋放LDH、NO和caspase-8活化的情況，并采用MTT法測定細胞增殖活性。

1.4統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1補體激活誘導內(nèi)皮細胞表達P-selectin補體激活產(chǎn)物能刺激內(nèi)皮細胞瞬時釋放P-selectin。在血清體積分數(shù)為15%、作用時間為20 min時，這種釋放作用達到最大(Fig 1)。

Fig 1 P-selectin expressed by endothelial cells after exposure to activated complement(n=3)

2.2補體激活誘導HMEC表達E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8的作用補體激活產(chǎn)物能刺激內(nèi)皮細胞上調(diào)表達 E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-8(Fig 2)。

2.3補體激活對內(nèi)皮細胞的損傷作用補體旁路激活能導致內(nèi)皮細胞釋放LDH增加(Fig 3)，凋亡信號caspase-8的活化出現(xiàn)上調(diào)，在6～12 h有明顯的增強(Fig 4)。同時，NO釋放下調(diào)(Fig 5)。經(jīng)激活的補體作用后，內(nèi)皮細胞的生長受到一定程度的抑制(Fig 6)。

Fig 2 Expression of proinflammatory molecules in endothelial cells after exposure to activated complement(n=3)

Fig 3 LDH released from endothelial cells after exposure to activated complement(n=4)

Fig 4 Activation of caspase-8 in endothelial cells after exposure to activated complement(n=4)

3 討論

補體的激活分為經(jīng)典、替代和凝集素途徑，而不同的活化途徑均有共同的活化末端路徑(C5-C9)。因此，獲得補體替代途徑激活所產(chǎn)生的所有特異性產(chǎn)物是本研究目標達成的關(guān)鍵。為此，我們采用了CVF來激活血清補體。CVF是來源于眼鏡蛇毒的一種高度特異的補體替代途徑激活蛋白。在血清環(huán)境中，CVF與補體B因子特異結(jié)合，形成CVFB復合物，CVFB經(jīng)D因子的特異識別和酶切，形成替代途徑C3/C5轉(zhuǎn)化酶CVFBb，CVFBb可持續(xù)激活補體替代途徑。這種激活模式與病理生理條件下體內(nèi)補體替代途徑的過度激活高度一致，其產(chǎn)物對血管內(nèi)皮細胞的作用和影響可以很好地模擬體內(nèi)補體旁路過度激活對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的效應(yīng)。因此，這個組合的實驗體系也為開展與補體相關(guān)的內(nèi)皮細胞保護及活性物質(zhì)篩選研究提供了一個合適的細胞模型。同時，通過該細胞模型的研究，也有助于認識CVF高效激活補體導致血管內(nèi)皮損傷和炎癥的作用在眼鏡蛇蛇傷毒性機制中所扮演的角色。

Fig 5 Effect of complement activation on production of NO by endothelial cells(n=4)

Fig 6 Effect of complement activation on cell proliferation(n=3)

據(jù)此，本研究觀察了補體旁路激活對內(nèi)皮細胞的影響和作用。結(jié)果表明，補體旁路激活導致內(nèi)皮細胞瞬時釋放P-selectin，并上調(diào)表達黏附分子E-selectin、ICAM-1和趨化因子 MCP-1、IL-8，使內(nèi)皮細胞釋放LDH增加，caspase-8活化上調(diào)，NO表達下調(diào)，細胞生長受到抑制。補體作為機體天然防御系統(tǒng)的重要一員，其正?？煽氐幕罨菍崿F(xiàn)免疫防御和調(diào)控作用的前提。但在諸多病理生理情況下，補體的活化會失控，從而引發(fā)炎癥和損傷。補體的激活，尤其是旁路激活，在一系列疾病和病理損傷中扮演了重要角色。而血管內(nèi)皮細胞無疑會成為補體激活后的重要靶標。在本研究中可以看到，補體旁路激活后首先會導致內(nèi)皮細胞瞬時表達P-selectin，這種表達在數(shù)分鐘內(nèi)即有明顯的變化，在20 min時升至高峰。隨后數(shù)小時內(nèi)，內(nèi)皮細胞開始上調(diào)表達E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8 這類通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達的黏附分子和炎癥介質(zhì)。補體替代途徑的激活，會產(chǎn)生C3a、C3b、C5a以及攻膜復合物(membrane attack complex，MAC)等多種活化產(chǎn)物。C5a不僅能刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞快速表達P-selectin，而且還能使多種黏附分子、細胞因子和趨化因子上調(diào)表達［8］。亞溶胞劑量的攻膜復合物 MAC能誘導 E-selectin、ICAM-1、MCP-1、IL-8 的表達上調(diào)［9－10］，而沒有溶胞活性的iTCC(inactive terminal complement complex)也具有同樣的作用［11］。P-selectin、E-selectin、ICAM-1是順序介導中性粒細胞與內(nèi)皮細胞黏附及跨膜遷移的重要分子，MCP-1和IL-8則具有促進中性粒細胞、巨噬細胞向內(nèi)皮細胞聚集和黏附的功能。本研究結(jié)果顯示，在受到補體旁路激活產(chǎn)物的刺激后，人微血管內(nèi)皮細胞順序出現(xiàn)了典型的內(nèi)皮細胞I型和II型活化［12］。血管內(nèi)皮細胞不僅構(gòu)成了血管平滑肌組織與血液間的物理性屏障，而且還是具有諸多重要生理調(diào)節(jié)活性的功能細胞。上述的活化刺激會導致內(nèi)皮細胞形態(tài)與功能的變化，而這種活化一旦持續(xù)，就會使內(nèi)皮細胞出現(xiàn)損傷和凋亡，從而破壞血管內(nèi)皮的完整性，引發(fā)后續(xù)的炎癥和損傷。

激活的補體旁路產(chǎn)物不僅刺激內(nèi)皮細胞活化，而且也對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生損傷。從本實驗看到，內(nèi)皮細胞經(jīng)CAC作用后，LDH釋放增加，提示內(nèi)皮細胞膜出現(xiàn)損傷和泄漏。這可能是CAC與內(nèi)皮細胞接觸后在細胞膜上生成了少量具有溶胞活性的MAC所致。而caspase-8的活化上調(diào)，表明CAC對內(nèi)皮細胞的刺激和作用會導致一定程度的凋亡，使內(nèi)皮細胞的增殖受到一定程度抑制。同時，內(nèi)皮細胞分泌NO明顯減少。NO是體內(nèi)重要的信號分子，具有多種重要的生理或病理生理作用［13］。血管內(nèi)皮細胞功能的紊亂，會導致NO的合成障礙［13］。以上結(jié)果提示，補體旁路激活會影響和損傷內(nèi)皮細胞的正常功能，進而產(chǎn)生相關(guān)的病理生理效應(yīng)。而在相關(guān)疾病和病理損傷中，采用合適有效的補體抑制劑阻斷補體相關(guān)激活產(chǎn)物的形成，從而抑制或減輕內(nèi)皮細胞的活化和損傷，則成為干預(yù)和治療的關(guān)鍵。因此，本實驗結(jié)果有助于進一步加深對補體激活引發(fā)炎癥和損傷效應(yīng)的認識和理解，為補體相關(guān)疾病及病理損傷的機制和干預(yù)治療新策略以及相關(guān)新藥的研究提供有益的參考和依據(jù)。

［1］Dunkelberger J R，Song W C.Complement and its role in innate and adaptive immune responses［J］.Cell Res，2010，20(1):34－50.

［2］Sarma J V，Ward P A.The complement system［J］.Cell Tissue Res，2011，343(1):227 －35.

［3］Wagner E，F(xiàn)rank M M.Therapeutic potential of complement modulation［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(1):43 － 56.

［4］Ricklin D，Hajishengallis G，Yang K，Lambris J D.Complement:a key system for immune surveillance and homeostasis［J］.Nat Immunol，2010，11(9):785 －97.

［5］Thurman J M，Holers V M.The central role of the alternative complement pathway in human disease［J］.J Immunol，2006，176(3):1305－10.

［6］Holers V M.The spectrum of complement alternative pathway-mediated diseases［J］.Immunol Rev，2008，223(1):300 －16.

［7］孫黔云，葉巧玲，閆銀萍.小鼠血清補體替代途徑溶血活性測定的新方法［J］.中國藥理學通報，2011，27(11):1619 －22.

［7］Sun Q Y，Ye Q L，Yan Y P.A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement［J］.Chin Pharma Bull，2011，27(11):1619 －22.

［8］Albrecht E A，Chinnaiyan A M，Varambally S，et al.C5a-induced gene expression in human umbilical vein endothelial cells［J］.Am J Pathol，2004，164(3):849 －59.

［9］Kilgore K S，Shen J P，Miller B F，et al.Enhancement by the complement membrane attack complex of tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cell expression of E-selectin and ICAM-1［J］.J Immunol，1995，155(3):1434 －41.

［10］Kilgore K S，F(xiàn)lory C M，Miller B F，et al.The membrane attack complex of complement induces interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1 secretion from human umbilical vein endothelial cells［J］.Am J Pathol，1996，149(3):953 －61.

［11］Bossi F，Bulla R，Tedesco F.Endothelial cells are a target of both complement and kinin system［J］.Int Immunopharmacol，2008，8(2):143－7.

［12］Zhang J，Defelice A F，Hanig J P，Colatsky T.Biomarkers of endothelial cell activation serve as potential surrogate markers for drug-induced vascular injury［J］.Toxicol Pathol，2010，38(6):856－71.

［13］Gkaliagkousi E，F(xiàn)erro A.Nitric oxide signalling in the regulation of cardiovascular and platelet function［J］.Front Biosci，2011，16:1873－97.