紅芪替代復(fù)芪止汗顆粒中的黃芪對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫作用的差異研究

張李峰， 衛(wèi)東鋒， 趙春燕， 程衛(wèi)東，3*， 桂曼曼， 李雪嫣

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000；3.北京師范大學(xué)資源學(xué)院，北京 100009）

紅芪替代復(fù)芪止汗顆粒中的黃芪對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫作用的差異研究

張李峰1， 衛(wèi)東鋒1， 趙春燕2， 程衛(wèi)東1，3*， 桂曼曼1， 李雪嫣1

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000；3.北京師范大學(xué)資源學(xué)院，北京 100009）

目的 比較復(fù)芪止汗顆粒中用紅芪與用黃芪對(duì)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。方法 小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，以相同劑量的紅芪替換復(fù)芪止汗顆粒中的黃芪后，分別灌胃，通過(guò)測(cè)定各組的巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅能力、脾淋巴細(xì)胞殺傷活性、T淋巴細(xì)胞亞群百分比、血清IL-1β的質(zhì)量濃度比較兩者對(duì)環(huán)磷酰胺的拮抗作用。結(jié)果 環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠經(jīng)復(fù)芪止汗顆粒和紅芪替換黃芪后的復(fù)芪止汗顆粒作用后血清中IL-1β質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加；含紅芪和黃芪的復(fù)芪止汗顆粒通過(guò)不同程度地增加小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力、殺傷活性、T淋巴細(xì)胞亞群百分比和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能發(fā)揮拮抗作用。含紅芪的復(fù)芪止汗顆粒在提高環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖能力和血清IL-1β質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面優(yōu)于含黃芪的復(fù)芪止汗顆粒。結(jié)論 紅芪與黃芪調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫方面具有相似作用，且在恢復(fù)T淋巴細(xì)胞增殖能力方面略優(yōu)于黃芪。

紅芪；黃芪；復(fù)芪止汗顆粒；免疫抑制；細(xì)胞免疫

中藥黃芪作為經(jīng)典扶正補(bǔ)益中藥，是許多復(fù)方和中成藥的重要成分，故對(duì)其需求量很大，又由于當(dāng)前中藥黃芪道地產(chǎn)區(qū)的不斷變換，來(lái)源品種較為復(fù)雜［1］，種質(zhì)存在退化現(xiàn)象，很難滿足日益發(fā)展的中藥材市場(chǎng)的需求［2］，這就急需擴(kuò)大藥源，尋找一味與之功能相近的中藥，以解決藥源不足、不純的現(xiàn)象。

紅芪與黃芪均來(lái)源于豆科植物，但不同屬，黃芪是豆科紫云英屬植物，而紅芪是巖黃芪屬植物，為多序巖黃芪的根。兩者均具有益氣、補(bǔ)血等功效，均是扶正固本、補(bǔ)中益氣的常用中藥［3-4］。紅芪的主要產(chǎn)地在甘肅省武都、岷縣、宕縣、舟曲等地，產(chǎn)量約占全國(guó)的95%以上，是甘肅優(yōu)質(zhì)道地藥材之一［5］，來(lái)源相對(duì)較純，另外其生長(zhǎng)對(duì)氣候條件的要求不是很嚴(yán)格，適宜其生長(zhǎng)的氣候范圍較廣，在種植、產(chǎn)量等方面較黃芪具有一定的優(yōu)勢(shì)［5］。幾千年來(lái)中醫(yī)治病，自古就有以紅芪替代黃芪入藥的習(xí)俗，尤以我國(guó)西北地區(qū)更為普遍［6-7］。1977年版《中國(guó)藥典》將紅芪列為正品黃芪之一［8］。直至1982年中科院院士肖培根等人將紅芪從黃芪中分出。1985年版《中國(guó)藥典》將紅芪作為一味常用補(bǔ)益藥而單獨(dú)分載［9］。

近年來(lái)隨著對(duì)紅芪研究以及紅芪與黃芪的比較研究的增多，發(fā)現(xiàn)兩者之間既有共同的成分，又在化學(xué)成分的含量和類型等方面存在明顯差異，尤其在皂苷類的差異更大［10］。趙健雄等［11］利用高效液相色譜法對(duì)紅芪和黃芪進(jìn)行鑒別發(fā)現(xiàn)在指紋圖譜中紅芪有23個(gè)特征峰而黃芪有26個(gè)，且紅芪中毛蕊異黃酮的含有量低于芒炳花素，黃芪則相反；紅芪不含黃芪中的黃芪甲苷。Liu等［12］報(bào)道黃芪和紅芪的黃酮類和皂苷類化合物在結(jié)構(gòu)上存在不同。李瑜等［4］發(fā)現(xiàn)紅芪染色體的數(shù)目為14條，而黃芪為16條［13］，這為兩者本質(zhì)上的區(qū)分提供了有力的細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

現(xiàn)代藥理研究結(jié)果顯示，紅芪與黃芪均具有免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)對(duì)兩者的效用方面的比較研究結(jié)果顯示也存在一定差異。胡燕等［14］比較了紅芪和黃芪水提物對(duì)小鼠的免疫功能影響的差異，結(jié)果表明兩者均能提高小鼠的免疫功能，而且紅芪水提物在部分指標(biāo)的提高作用上優(yōu)于黃芪水提物。并且兩者體外均能清除自由基，且紅芪水提物的作用稍強(qiáng)［15］。余黎等［16］則報(bào)道黃芪水提物激活巨噬細(xì)胞的作用強(qiáng)于紅芪水提物。Wang等［17］發(fā)現(xiàn)紅芪多糖 （HPS）和黃芪多糖 （APS）均可明顯增加腹腔巨噬細(xì)胞的數(shù)量和C3的沉積，而且注射5次后C3陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的比例明顯比只注射1次多。毛小娟等［18-19］比較了紅芪多糖和黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)兩者均能增強(qiáng)正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫功能，且紅芪多糖的體液免疫調(diào)節(jié)作用比黃芪多糖強(qiáng)。Liu等［12］發(fā)現(xiàn)黃芪和紅芪中的皂苷和黃酮類化合物在免疫效應(yīng)方面同樣存在著一定差異。

而中藥復(fù)方是以君藥為主要藥物，通過(guò)君、臣、佐、使作用體現(xiàn)復(fù)方的整體功效［20］，所以基于復(fù)方——比較紅芪與黃芪的效用至關(guān)重要，而目前在復(fù)方水平比較紅芪與黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，故本研究以益氣固表斂汗的經(jīng)典復(fù)方復(fù)芪止汗顆粒為研究對(duì)象，在復(fù)方水平比較紅芪或黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用，為中藥復(fù)方增強(qiáng)免疫功能尋找新的藥對(duì)配伍和治療靶點(diǎn)，同時(shí)可彌補(bǔ)紅芪藥理研究和藥用理論的不足。

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞 健康昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（甘）2009-0004。人髓系白血病細(xì)胞株K562由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物 復(fù)芪止汗顆粒為上海雷允上藥業(yè)有限公司產(chǎn)品 （國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020475）。實(shí)驗(yàn)用飲片購(gòu)于蘭州市黃河藥材市場(chǎng)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)藺海明教授鑒定合格。參照2010年《中華人民共和國(guó)藥典》［3］的劑量，并按照體表面積［21］換算為小鼠的劑量即27 g生藥/（kg·d）。以相同劑量的紅芪替換黃芪后與黨參、白術(shù)、麻黃根、五味子、牡蠣配制成復(fù)芪止汗復(fù)方，加入適量水浸泡0.5～1 h，煎煮兩次 （1.5 h，1 h），合并濾液，將藥物濃縮至每毫升含生藥1 g，4℃冷藏備用。環(huán)磷酰胺為山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要試劑及儀器 改良型RPMI-1640培養(yǎng)液為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；青霉素、鏈霉素為華北制藥有限公司生產(chǎn)；胎牛血清為杭州四季青公司生產(chǎn)；胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；臺(tái)盼藍(lán)為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，小鼠乳酸脫氫酶 （LDH）酶聯(lián)試劑盒為甘肅鵬程生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；小鼠IL-1β ELISA試劑盒和EZ-SepTMMOUSE 1X淋巴細(xì)胞分離液為深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；PE/Cy5-抗小鼠CD4、PE-抗小鼠CD8和FITC-抗小鼠CD3單克隆抗體為Biolegend產(chǎn)品；ConA、MTT為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品；NP40為Fluka公司產(chǎn)品產(chǎn)；超凈工作臺(tái)為蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為德國(guó)Olympus公司產(chǎn)品；iMark全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)BOI-RAD公司產(chǎn)品流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼COULTER公司產(chǎn)品，型號(hào)Epics XL；AF2-0502-U型超純水機(jī)為艾科浦公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板及血球計(jì)數(shù)板為西安科昊生物工程有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 免疫抑制小鼠模型的建立［22］每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/（kg·d），連續(xù)7 d，建立免疫抑制小鼠模型。

2.2 分組及給藥 取昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺模型組、復(fù)芪止汗顆粒+環(huán)磷酰胺模型組 （黃復(fù)組）和相同劑量紅芪替換黃芪后的復(fù)芪止汗水提物+環(huán)磷酰胺模型組 （紅復(fù)組），每組10只?？瞻讓?duì)照組給予0.9%生理鹽水，中藥各組分別給予27 g生藥/（kg·d），各組均按10 g/d給予0.2 mL，連續(xù)灌胃14 d。

2.3 脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備［23］實(shí)驗(yàn)第15天，稱各組小鼠體質(zhì)量，眼球摘除采血處死，無(wú)菌取脾臟完全按EZ-SepTMMOUSE1X淋巴細(xì)胞分離液的說(shuō)明書進(jìn)行操作，制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。

2.4 脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定［24］取2.3項(xiàng)所得的各組脾臟淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，各樣本加6個(gè)孔，100 μL/孔，其中三孔加 ConA 100 μL（終質(zhì)量濃度為 5 μg/mL），三孔不加ConA。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，加MTT 20 μL/孔 （終質(zhì)量濃度為5 mg/mL），培養(yǎng)結(jié)束后，加10%SDS 100 μL/孔，37℃過(guò)夜，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定吸光度A值。計(jì)算刺激指數(shù)。

刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值

2.5 脾臟淋巴細(xì)胞殺傷活性測(cè)定［25］

2.5.1 K562細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液的制備 K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活 （56℃，30 min）胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液含NaHCO32.0 g/L、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，約2～3 d傳代1次。K562細(xì)胞活力測(cè)定：取傳代培養(yǎng)后呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按常規(guī)方法制成單細(xì)胞懸液，用0.04%的臺(tái)盼藍(lán)與細(xì)胞懸液1∶1混勻，用WBC計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)后計(jì)算細(xì)胞活力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL備用。

2.5.2 測(cè)定脾淋巴細(xì)胞殺傷活性 取K562靶細(xì)胞懸液 （1×105個(gè)/mL）和脾臟淋巴細(xì)胞懸液 （5×106個(gè)/mL）各100 μL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔即加靶細(xì)胞懸液和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔即加靶細(xì)胞懸液和1%NP-40各100 μL；各樣本設(shè)三個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育22 h后，取上清100 μL/孔，嚴(yán)格按乳酸脫氫酶酶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，結(jié)果經(jīng)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（A）值，按下式計(jì)算脾臟淋巴細(xì)胞的殺傷活性。計(jì)算公式如下：

殺傷活性 =（反應(yīng)孔A值-自然釋放孔 A值）/（最大釋放孔 A值 -自然釋放孔 A值）×100%

2.6 脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 取脾臟淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，取100 μL各組脾淋巴細(xì)胞懸液 （約含1×106個(gè)細(xì)胞），加 入 1 μL FITC-抗 小 鼠 CD3+、1.25 μL PE/Cy5-抗小鼠 CD4+和 1.25 μL PE- 抗小鼠CD8+，輕輕旋轉(zhuǎn)混合，4℃避光孵育30 min，洗細(xì)胞，細(xì)胞沉淀中加入500 μL流式緩沖液，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析各組脾淋巴細(xì)胞亞群百分比含量。

2.7 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅功能測(cè)定［26］取各組小鼠腹腔液，離心洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。混勻后取細(xì)胞懸液100 μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，去除培養(yǎng)液，加0.072%中性紅溶液100 μL/孔。繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次，加細(xì)胞裂解液 （無(wú)水乙醇-0.1 mol/L冰乙酸=1∶1）100 μL/孔，4℃過(guò)夜，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定吸光度A值。

2.8 血清IL-1β質(zhì)量濃度的測(cè)定 取各小鼠血清，嚴(yán)格按照IL-1 βELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各反應(yīng)孔A值作為檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本IL-1β質(zhì)量濃度，單位為pg/mL。

2.9 數(shù)據(jù)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和殺傷活性的影響與空白對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺能明顯降低脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力 （P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺組比較，黃復(fù)組和紅復(fù)組均能提高免疫抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力 （P＜0.05，P＜0.01），但紅復(fù)組較黃復(fù)組作用顯著 （P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺模型組脾臟淋巴細(xì)胞殺傷活性明顯降低（P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃復(fù)組和紅復(fù)組均能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞殺傷活性 （P＜0.01），但二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 黃復(fù)組和紅復(fù)組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和殺傷活性的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative Fuqi Zhihan groups on proliferation and cytotoxic activity of lymphocytes（±s，n=10）

表1 黃復(fù)組和紅復(fù)組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和殺傷活性的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative Fuqi Zhihan groups on proliferation and cytotoxic activity of lymphocytes（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與環(huán)磷酰胺模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與黃復(fù)組比較，▲P＜0.05。

組別 劑量/（g·kg-1） 淋巴細(xì)胞增殖功能刺激指數(shù) 殺傷活性/%空白對(duì)照組-1.27±0.07 23.02±2.01環(huán)磷酰胺組 0.05 1.08±0.11＊＊ 8.02±1.07＊＊黃復(fù)組 6 1.18±0.65# 18.77±3.05*##紅復(fù)組 6 1.28±0.38##▲ 20.83±4.32##

3.2 對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與空白對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺能明顯降低小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+和 CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的含有量，且CD8+T淋巴細(xì)胞含有量降低較為明顯，導(dǎo)致CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比值顯著增加 （P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃復(fù)組和紅復(fù)組可不同程度的增高免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞中 CD3+、CD4+和 CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比，與環(huán)磷酰胺模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），但紅復(fù)組與黃復(fù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃復(fù)組和紅復(fù)組對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative Fuqi Zhihan groups on the T lymphocyte subgroup in immunosuppressed mice（±s，n=10）

表2 黃復(fù)組和紅復(fù)組對(duì)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative Fuqi Zhihan groups on the T lymphocyte subgroup in immunosuppressed mice（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01；與環(huán)磷酰胺模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量/（g·kg-1）CD4+/%CD8+/% CD4+/CD8+空白對(duì)照組- 39.13±2.20 29.03±9.21 1.47±0.56環(huán)磷酰胺組 0.05 33.37 ±3.19＊＊ 15.67±3.95＊＊ 2.19±0.43＊＊黃復(fù)組 6 37.95±1.72## 25.13±1.24# 1.46±0.36#紅復(fù)組 6 39.86±2.34## 29.52±3.79##1.35±0.45#

3.3 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響與空白對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺能明顯降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力 （P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺模型組比較，黃復(fù)組和紅復(fù)組均能提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅的能力 （P＜0.05），紅復(fù)組作用較強(qiáng) （P＜0.01），但仍低于空白對(duì)照組 （P＜0.05），且紅復(fù)組與黃復(fù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 黃復(fù)組和含復(fù)組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響（±s，n=10）Tab.3 Effect of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative Fuqi Zhihan groups on the phagocytosis of mouse peritoneal macrophages（±s，n=10）

表3 黃復(fù)組和含復(fù)組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響（±s，n=10）Tab.3 Effect of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative Fuqi Zhihan groups on the phagocytosis of mouse peritoneal macrophages（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 劑量/（g·kg-1） 吞噬中性紅 （A570nm ）空白對(duì)照組-1.66±0.49環(huán)磷酰胺模型組 0.05 0.84±0.10＊＊黃復(fù)組 6 1.23 ±0.13＊＊#紅復(fù)組 6 1.31±0.15*##

3.4 對(duì)血清IL-1β的影響 與空白對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺模型組血清IL-1β質(zhì)量濃度明顯降低 （P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺組比較，黃復(fù)組和紅復(fù)組均能顯著提高免疫抑制小鼠血清IL-1β的質(zhì)量濃度（P＜0.01）。與黃復(fù)組較相比，紅復(fù)組作用較強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見(jiàn)表4。

4 討論

復(fù)芪止汗顆粒是益氣固表斂汗的經(jīng)典方劑，以黃芪為君藥與黨參、麻黃根、白術(shù)等配伍，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)以該方為研究對(duì)象，觀察紅芪與黨參、麻黃根、白術(shù)、牡蠣、五味子配伍后與原方在免疫調(diào)節(jié)方面的差異。

表4 黃復(fù)組和紅復(fù)組對(duì)巨噬細(xì)胞誘生IL-1β的影響 （±s，n=10）Tab.4 Effect of Radix Hedysari and Radix Astragali alternative Fuqi Zhihan groups on the mouse macrophage induced IL-1β production（±s，n=10）

表4 黃復(fù)組和紅復(fù)組對(duì)巨噬細(xì)胞誘生IL-1β的影響 （±s，n=10）Tab.4 Effect of Radix Hedysari and Radix Astragali alternative Fuqi Zhihan groups on the mouse macrophage induced IL-1β production（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與環(huán)磷酰胺模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，與黃復(fù)組比較，▲P＜0.05。

組別 劑量/（g·kg-1） IL-1β/（pg·mL-1）空白對(duì)照組-129.69±14.5環(huán)磷酰胺模型組 0.05 78.73±7.86＊＊黃復(fù)組 6 99.69±10.02＊＊##紅復(fù)組 6 113.77±15.99*##▲

本實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型作為動(dòng)物體內(nèi)受試模型，觀察以紅芪和黃芪為君藥的復(fù)芪止汗顆粒對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能的影響，首先觀察到健康昆明種小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，小鼠的各項(xiàng)免疫指標(biāo)均明顯降低，表明免疫抑制模型已成功建立。這與免疫抑制劑環(huán)磷酰胺的作用位點(diǎn)有關(guān)系，環(huán)磷酰胺可通過(guò)干擾細(xì)胞核酸的合成，可能在細(xì)胞周期的任何時(shí)期均起作用［27］，進(jìn)一步觀察可見(jiàn)含黃芪和含紅芪的復(fù)芪止汗顆粒均可顯著提高免疫抑制小鼠的各項(xiàng)免疫指標(biāo)，表明紅芪或黃芪與黨參、麻黃根、白術(shù)、牡蠣、五味子配伍后均可以改善免疫抑制機(jī)體的免疫功能。

MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)可以反映機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖能力，T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是一種反映細(xì)胞免疫功能的常用方法，具有一定的可靠性和簡(jiǎn)易性等特點(diǎn)［28］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含黃芪和含紅芪的復(fù)芪止汗顆粒均可以不同程度地促進(jìn)免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖，且紅復(fù)組較黃復(fù)組作用明顯，能明顯逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。當(dāng)K562靶細(xì)胞的細(xì)胞膜受損后，胞質(zhì)中的乳酸脫氫酶會(huì)釋放出來(lái)，根據(jù)檢測(cè)含乳酸脫氫酶量的多少可以判斷脾淋巴細(xì)胞包括NK細(xì)胞的殺傷活性［29］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含紅芪和含黃芪的復(fù)芪止汗顆粒均能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞殺傷活性，且二者作用無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)各組小鼠外周血液的淋巴細(xì)胞亞群分布測(cè)定結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺能明顯減少CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，給予含紅芪或含黃芪的復(fù)芪止汗顆粒一段時(shí)間后，CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均明顯回升，并接近空白對(duì)照組水平，說(shuō)明二者均能改善免疫抑制小鼠的T淋巴細(xì)胞亞群的失衡。

巨噬細(xì)胞是誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，能夠增強(qiáng)局部組織對(duì)環(huán)境污染物及細(xì)菌的防御能力［30］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃復(fù)組和紅復(fù)組均能顯著提高環(huán)磷酰胺引起的腹腔巨噬吞噬能力的降低，促進(jìn)免疫抑制小鼠對(duì)不利因素的免疫抵抗。IL-1β是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，可以作用于巨噬細(xì)胞和Th細(xì)胞，在固有免疫應(yīng)答和適用性免疫與應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用［31］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃復(fù)組或紅復(fù)組可使免疫抑制小鼠血清IL-1β的質(zhì)量濃度明顯增加，且紅復(fù)組的作用較強(qiáng)，表明紅芪和黃芪與黨參、麻黃根、白術(shù)、牡蠣、五味子配伍后對(duì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用相近；同時(shí)紅復(fù)組脾T淋巴細(xì)胞增殖能力增加可能與血清中IL-1β質(zhì)量分?jǐn)?shù)增多有關(guān)系，具體作用機(jī)制還有待于在分子水平進(jìn)一步深入探討。

本研究通過(guò)比較含紅芪與含黃芪的復(fù)芪止汗顆粒對(duì)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明二者在增強(qiáng)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能方面作用相近，同時(shí)紅復(fù)組在恢復(fù)脾臟T淋巴細(xì)胞增殖方面優(yōu)于黃復(fù)組。因此，紅芪替換復(fù)方中的黃芪具有一定科學(xué)性，尤其在免疫調(diào)節(jié)方面。另外有關(guān)紅芪和黃芪在其它復(fù)方中能否替代仍需進(jìn)一步的深入研究。

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Differences of Hedysari Radix and Astragali Radix alternative in Fuqi Zhihan Granules on immunity in immunosuppressed mice

ZHANG Li-feng1， WEI Dong-feng1， ZHAO Chun-yan2， CHENG Wei-dong1，3*， GUI Man-man1，LI Xue-yan1

（1.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3.College of Resources Science＆Technology，Beijing Normal University，Beijing 100009，China）

AIMTo comparatively study the differences of Fuqi Zhihan Granules on immunosuppressed mice in cellular immunity in the substitution of Hedysari Radix for Astragali Radix.METHODSMice injected intraperitoneally with cyclophosphamide were modeled into the immunosuppressed mouse and intragastrically administered with the same dose of Hedysari Radix replaced by Astragali Radix in Fuqi Zhihan Granules through the determination of macrophages in vitro macrophage phagocytic capacity，spleen lymphocyte killing activity，the percentage of T lymphocyte subsets，serum IL-1β level to compare both cyclophosphamide antagonism.RESULTSFuqi Zhihan Granules containing Hedysari Radix and Astragali Radix could significantly increase the level of IL-1β，and antagonize immunosuppressive effect caused by cyclophosphamide，concluding promoting T lymphocyte proliferation，cytotoxic activity of NK cell，quantity of T lymphocyte subgroup，and phagocytosis of the macrophage of varying degrees.Hedysari Radix was superb to Astragali Radix in Fuqi Zhihan Granules in raising T lymphocyte proliferation and IL-1β level.CONCLUSIONHedysari Radix has a similar role in cell immunity regulation with Astragali Radix，and Hedysari Radix has better effect in T cell proliferation.

Hedysari Radix；Astragali Radix；Fuqi Zhihan Granules；immunosuppression；cytoimmunity

R285.5

A

1001-1528（2012）08-1415-06

2011-11-04

中國(guó)博士后科學(xué)基金資助 （20090450017）；中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助 （201003073）；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（200807330006）

張李峰 （1975—），女，博士生，研究方向：中藥免疫學(xué)。Tel：13993126931，E-mail：zhanglf@lzu.edu.cn

*通信作者：程衛(wèi)東 （1963—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：（0931）-8915184，E-mail：chengweidong888@sina.com