青海省藏羊感染皮蠅蛆調(diào)查及其蟲(chóng)種鑒定

朵 紅

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

皮蠅病是由狂蠅科皮蠅屬的牛皮蠅、紋皮蠅和中華皮蠅的幼蟲(chóng)引起的一種慢性寄生蟲(chóng)病。病原皮蠅幼蟲(chóng)(蠅蛆)主要寄生于牦牛、黃牛，偶而寄生于羊、鹿、麝、野牛、馬等動(dòng)物[1-2]。皮蠅幼蟲(chóng)的寄生導(dǎo)致患畜消瘦，幼畜發(fā)育遲緩，產(chǎn)乳量下降，皮革質(zhì)量降低，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并直接影響動(dòng)物生產(chǎn)性能和存活率[3-5]。青海地區(qū)牦牛體上寄生的皮蠅蟲(chóng)種為中華皮蠅、牛皮蠅和紋皮蠅混合感染，其中中華皮蠅是牦牛體上寄生的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種[6]。

關(guān)于藏羊感染皮蠅蛆的報(bào)道較少[7-8]，2008年～2010年我們對(duì)青海省藏羊感染皮蠅蛆進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)藏羊存在皮蠅蛆感染，并收集一、二期幼蟲(chóng)，為了解感染藏羊的皮蠅蛆與感染牦牛的皮蠅蛆之間的種屬關(guān)系，我們對(duì)青海省感染藏羊和牦牛的皮蠅蛆進(jìn)行線粒體CO1基因序列的比較研究。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)株及臨床樣品 于2008年～2010年3月～5月份在青海省瑪沁縣、剛察縣某種羊場(chǎng)，貴南縣隨機(jī)抽樣進(jìn)行藏羊皮蠅蛆病感染狀況調(diào)查，調(diào)查藏羊476只；在貴南縣、海晏縣、民和縣收集感染牦牛的皮蠅蛆，并以70%酒精固定。根據(jù)收集地區(qū)分別編號(hào)皮蠅海晏株、民和株、藏羊株1(剛察縣某羊場(chǎng))、藏羊株2(果洛)、黃南株、貴南株；另一株為本研究室于1989年在黃南州收集的感染牦牛的皮蠅蛆(70%酒精固定)。

1.2 主要試劑 TIANamp Genomic DNA Kit購(gòu)自TIAGEN公司；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500-01購(gòu)自蘭州維科生物工程有限責(zé)任公司；PremixTaq酶、pGEM-T載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 調(diào)查方法 對(duì)調(diào)查的藏羊群逐只進(jìn)行摸背檢查，計(jì)數(shù)皮蠅瘤胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)瘤胞寄生部位，最后計(jì)算藏羊的感染率和感染強(qiáng)度。

1.4 蟲(chóng)體基因組DNA樣品提取 將酒精固定的皮蠅蛆除酒精，取皮蠅蛆內(nèi)容物約10 mg，按TIANamp Genomic DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取總DNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)和目的片段PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)上游引物UEA7(5'-TACAGTTGGAATAGACG TTGATAC-3')和下游引物UEA10(5'-TCCAATGCAC TAATCTGCCATATTA-3')，由Invitrogen公司合成。將提取的基因組總DNA進(jìn)行線粒體CO1基因片段PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃4 min；94℃30 s、54℃1 min、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 PCR產(chǎn)物的純化回收及目的基因的克隆和測(cè)序 按照Gel Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將目的片段與pGEM-T載體連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，菌液經(jīng)PCR鑒定，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 進(jìn)化樹(shù)及同源性分析 應(yīng)用DNAStar軟件包中的MegA lign軟件對(duì)所獲得的線粒體CO1基因序列進(jìn)行序列比較，構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)和基因序列同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 青海省藏羊感染皮蠅蛆調(diào)查結(jié)果 共調(diào)查藏羊476只，其中14只為陽(yáng)性，感染率為2.9%，總瘤胞數(shù)為27個(gè)，平均感染強(qiáng)度為1.9個(gè)。其中瑪沁縣調(diào)查藏羊56只，1只為陽(yáng)性，感染率為1.7%，瘤胞數(shù)為1個(gè)，平均感染強(qiáng)度為1個(gè)；貴南縣調(diào)查藏羊300只，9只為陽(yáng)性，感染率為3%，瘤胞數(shù)為16個(gè)，平均感染強(qiáng)度為1.8個(gè)；剛察縣某種羊場(chǎng)調(diào)查藏羊120只，4只為陽(yáng)性，感染率為3.3%，瘤胞數(shù)為10個(gè)，平均感染強(qiáng)度為2.5個(gè)。

2.2 目的基因的擴(kuò)增 采用引物UEA7和UEA10擴(kuò)增出大小約為690 bp的CO1核苷酸片段，與預(yù)期相符(圖1)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。

圖1 皮蠅蛆PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplification of CO1 gene from the Hypoderma larvaesisolates by PCR

圖2 蠅蛆株線粒體CO1基因片段聚類分析進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Hypoderma larvaesstrains Mitochondrial CO1 gene tree cluster analysis

同源性比較結(jié)果顯示：青海省2株感染藏羊的皮蠅蛆與感染牦牛的民和株和黃南株，在線粒體CO1基因片段聚類分析進(jìn)化樹(shù)和同源性比較中，與牛皮蠅位于同一個(gè)進(jìn)化分支上，基因片段同源性大于99%，為牛皮蠅；感染牦牛的海晏株和貴南株在線粒體CO1基因片段聚類分析進(jìn)化樹(shù)和同源性比較中，與中華皮蠅位于同一個(gè)進(jìn)化分支上，基因片段同源性大于99%，為中華皮蠅；幾株皮蠅蛆種內(nèi)變異率小于1%，種間變異率大于8%。

3 討論

本研究于2008年～2010年在青海省部分地區(qū)調(diào)查藏羊感染皮蠅蛆狀況，結(jié)果顯示平均感染率為2.9%，但在調(diào)查時(shí)未發(fā)現(xiàn)感染藏羊的皮蠅幼蟲(chóng)發(fā)育到三期幼蟲(chóng)或脫離的現(xiàn)象，認(rèn)為皮蠅蛆感染藏羊?yàn)橐环N盲途感染，調(diào)查中收集的2株感染藏羊的皮蠅蛆均為牛皮蠅。郭仁民報(bào)道綿羊黑色羔羊的皮蠅蛆感染率達(dá)90%，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察認(rèn)為感染蟲(chóng)種為紋皮蠅[7]。本研究結(jié)果與郭仁民等的研究結(jié)果存在差異[3-4,7]，這可能與所收集的蟲(chóng)種或研究方法的不同有一定關(guān)系。

CO1為線粒體上細(xì)胞色素C氧化酶的一個(gè)亞單位，其核苷酸序列具有昆蟲(chóng)種屬特異性，這一區(qū)域是昆蟲(chóng)之間變化最高的區(qū)域，充分表明生物線粒體CO1基因核苷酸堿基序列在一定程度上能夠反映出科、屬、種和株間在進(jìn)化上的差異性[10]。我們選擇線粒體CO1基因上的細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1，研究青海省感染牦牛和藏羊的幾株皮蠅蛆，種內(nèi)變異率小于1%，種間變異率大于8%。Otranto等對(duì)狂蠅科內(nèi)能引起專性蠅蛆病的18個(gè)屬種的CO1基因進(jìn)行了研究，表明皮蠅科種內(nèi)變異率為0.14%～1.59%，種間變異率為8.4%～16.4%[11]，本研究結(jié)果與該結(jié)果一致。

此前我們對(duì)感染藏羊皮蠅蛆和感染牦牛的中華皮蠅蛆進(jìn)行了電子顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)兩者在形態(tài)上稍有差異[12]，而通過(guò)序列分析研究進(jìn)一步證實(shí)我們收集的感染藏羊的皮蠅蛆為牛皮蠅蛆。

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