污水中解有機(jī)磷微生物的篩選

黃巧娟，陳禮剛，蔣端生，王雙輝

(湖南人文科技學(xué)院 生命科學(xué)系，湖南 婁底 417000)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展的加快和人口的不斷增長，我國水環(huán)境問題日益嚴(yán)重，水體富營養(yǎng)化尤其突出。氮、磷的輸入尤其是磷的濃度升高是引起水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵因素，城鎮(zhèn)生活污水的排放是水體磷污染的主要來源之一[1-3]。富營養(yǎng)化會影響水體的水質(zhì)和水中植物的光合作用，造成魚類大量死亡。富營養(yǎng)化的水中含有硝酸鹽和亞硝酸鹽，人畜長期飲用這些物質(zhì)含量超過一定標(biāo)準(zhǔn)的水，也會中毒致病，對人類產(chǎn)生嚴(yán)重的潛在威脅。為解決磷污染所帶來的危害，在污水進(jìn)入水體之前進(jìn)行有效處理，降低排放污水的磷濃度十分必要[4]。

目前國內(nèi)外對降解有機(jī)磷的微生物有不少的報(bào)道，但大部分是在對土壤中有機(jī)磷細(xì)菌的研究[5-6]，而從污水中分離有機(jī)磷降解菌的報(bào)道比較少，最新研究表明聚磷污泥是由幾種不同的菌屬組成[7]。本試驗(yàn)從不同污泥樣品中篩選降解有機(jī)磷的菌株，并對其解磷能力進(jìn)行初步測定，為探索微生物除磷在污水處理中的應(yīng)用提供參考。

一 材料與方法

(一)樣品

2011年4月，在湖南人文科技學(xué)院采取生活污泥(A)、污水溝污泥(B)、養(yǎng)魚池污泥(C)作為試樣。

(二)培養(yǎng)基

有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：10g蛋白胨, 3g牛肉膏, 5g NaCl,溶于1000ml水，滅菌后，待培養(yǎng)液冷卻到50℃以下，立即加入50ml由無菌生理鹽水與現(xiàn)取卵黃按1:1比例配制的卵黃液。

有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：將1000ml加瓊脂的液體培養(yǎng)基冷卻到50℃以下，立即加入50ml由無菌生理鹽水與現(xiàn)取卵黃按1:1比例配制的卵黃液，并移入平板。

(三)試驗(yàn)方法

1. 菌種富集培養(yǎng)

分別取污泥樣品裝入三個(gè)容量為500ml，裝有200ml有機(jī)磷培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃，130r/min中的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)3d，如此重復(fù)3次，使細(xì)菌迅速繁殖。

2. 菌種分離純化

用無菌移液管取1mL富集培養(yǎng)液的上清液，于盛有9ml無菌水的試管中，混勻，制成濃度梯度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍的稀釋液。從各濃度梯度分別吸取0.1 mL稀釋液于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板，均勻涂布。28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)，每隔24h觀察一次，記錄菌種的生長情況。能產(chǎn)生透明圈的菌株即為解磷菌，將透明圈大的菌株挑出，進(jìn)一步劃線法純化，得到純菌株后，置于4℃冰箱中保藏。

3. 解磷能力的測定

透明圈法：將篩選到的菌株點(diǎn)接于固體平板中，培養(yǎng)數(shù)天，通過觀察透明圈大小，測定菌落直徑d和透明圈直徑D[8]。

二 結(jié)果與分析

(一)解磷細(xì)菌的篩選

采用平板劃線法將得到的菌株分離純化，部分結(jié)果如下(如圖1)。

觀察分離純化時(shí)的菌落形態(tài)，得到共有6株能解有機(jī)磷的微生物。A、B、C三個(gè)樣品中均篩選出了解磷菌，其中C組篩選出的解磷菌解磷能力較強(qiáng)，并且菌株生長較好。對C組進(jìn)行復(fù)篩，共篩出六個(gè)菌株，下表為經(jīng)過48h的恒溫培養(yǎng)后，六個(gè)菌株的菌落形態(tài)特征。

由表1可以看出，篩選出的解磷菌株多為白色圓形菌株。并且菌株多集中于10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9幾個(gè)溶度梯度。其中，菌株邊緣主要有規(guī)則、不規(guī)則、鋸齒狀幾種。

表1 各類解有機(jī)磷細(xì)菌菌體菌落形態(tài)特征

(二)細(xì)菌解磷能力的初步測定

將篩選出的六個(gè)菌株接種在有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，按24，48，72，96，120h取出觀察，結(jié)果詳見表2。

表2 透明圈法測定解磷微生物解磷能力

通過以上數(shù)據(jù)可以看出：在24h-48h這段時(shí)間內(nèi)，解磷菌的菌落增長最快；在48h-72h這段時(shí)間內(nèi)，解磷菌的解磷圈增長最快；在96h后解磷菌的解磷能力逐漸減弱；六種具有解磷能力的解磷菌中平均解磷能力強(qiáng)弱依次為 6號>3號>5號>1號>2號>4號， 3號和5號菌株解磷能力穩(wěn)步增長，透明圈最大達(dá)到3.0mm；而6號菌株解磷能力最強(qiáng)，在72h時(shí)D/d達(dá)5.0。

三 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從A、B、C三種污泥樣品中篩選降解有機(jī)磷的菌株，其中從C組篩出的菌株解磷能力較強(qiáng)，生長較好。對C組進(jìn)行復(fù)篩，共篩出六個(gè)菌株，并對其解磷能力進(jìn)行初步測定。

試驗(yàn)結(jié)果表明，而多數(shù)研究者采用的蒙金娜培養(yǎng)基[5,8]不適合C組解磷菌的生長，故本試驗(yàn)直接采用添加了卵黃液的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基。篩選出的菌株解磷能力強(qiáng)弱依次為 6號>3號>5號>1號>2號>4號。其中，6號菌株的D/d達(dá)5.0，3號和5號菌株生長良好，菌落均呈圓形，菌落小而透明圈大，三個(gè)菌株在培養(yǎng)了120h后仍呈現(xiàn)較強(qiáng)的解磷能力。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會．水和廢水監(jiān)測分析方法[M ]． 4版．北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：243-250．

[2]洪葵，陳國強(qiáng)，黃為一，等．羥基丁酸及中鏈羥基脂肪酸共聚物的微生物合成[J]．微生物學(xué)報(bào)，1998，25(2)：110-113．

[3]HEIN S，PALETTA J R J，STEINBUCHEL A．Cloning，characterization and comparison of the Pseudomonas mendocina polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2[J]．Appl Microbiol Biotehchnol．2002(58)：229-236．

[4]SUDESH K，ABE H，DOI Y．Synthesis，structure and properties of polyhydroxyalkanoates： biologicalpolyesters[J]．Prog．Polym．Sci．2000(25)：1503-1555．

[5]趙小蓉，林啟美．微生物解磷的研究進(jìn)展[J]．土壤肥料，2001，5(3)：7-11．

[6]MINO T, VAN L M, HEIJNEN J. Microbiology and Biochemistry of the Enhanced Biological Phosphate Removal Process[J]. Water Res,1998,32(11):3193-3207.

[7]馮月紅，姚拓，龍瑞軍．土壤解磷菌研究進(jìn)展[J]．草原與草坪，2003，100(1)：3-5．

[8]胡子全，趙海泉．一株有機(jī)解磷菌的篩選及其最佳生長條件的研究[J]．中國給水排水，2007(17)：66-70．