酶法水解VC磷酸酯鎂及其動力學(xué)分析

郎愛花，劉惠青，車 影，閆果蘭，靳利娥

（1.太原理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，太原030024；2.山西廣播電視大學(xué)，太原030027）

具有抗氧化性的維生素C（VC）是人與動物非常重要的營養(yǎng)物質(zhì)［1－2］。他們自身不能合成，需要從外界攝取足量的VC以供其正常生長發(fā)育，但是VC具有很強的還原性，極不穩(wěn)定，容易被熱、光、氧破壞，在中性或堿性溶液中尤為嚴(yán)重［3－4］。VC的不穩(wěn)定性成為其使用過程中的一大障礙，因此，人們研制出了它的衍生物，VC磷酸酯鎂（Magnesium Ascorbyl Phosphate，MAP）就是其中一種。

MAP是一種無嗅、無味的白色粉末，由VC的2位烯醇羥基磷酸酯化而成，是我國批準(zhǔn)使用的食品添加劑和營養(yǎng)強化劑［5］。它既具有VC所有的功效，又克服了VC易被光、熱及金屬離子等氧化的缺點，能長期儲存，被廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥等行業(yè)中［6－7］。磷酸酯酶（Phosphoesterase Complex，PC）能使 MAP水解為VC，發(fā)揮VC特有的生理生化功能［8］。因此補充MAP的同時，因人體中磷酸酯酶不足，需要服用適量的磷酸酯酶腸溶片。因此有必要從理論上探討如何合理利用PC。本研究利用PC體外水解MAP，給出了優(yōu)化水解最佳條件及其動力學(xué)分析，為進一步有效利用MAP提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

VC磷酸酯鎂，陜西森弗高科實業(yè)有限公司；復(fù)合磷酸酯酶腸溶片，青島漢河藥業(yè)有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；DF-Ⅱ集熱式恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇市億通電子有限公司；pHS-3C數(shù)顯酸度計，上海宇隆儀器有限公司。

1.3 方法

取1g去掉糖衣的復(fù)合磷酸酯酶腸溶片溶解在100mL蒸餾水中，配制成酶溶液。放在冰箱中保存?zhèn)溆?。取一定量濃度的底物，加酶量，改變pH值，在一定溫度下水解，計算水解率。實驗通過改變一個反應(yīng)條件、固定其它反應(yīng)條件進行單因素實驗，利用水解率選擇最佳水解條件。在最佳水解條件下改變底物濃度，測定反應(yīng)速率，擬合反應(yīng)動力學(xué)方程。

VC含量的測定采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 7303－2006《飼料添加劑 維生素 C（L-抗壞血酸）》［9］，在酸性介質(zhì)中VC與碘液發(fā)生定量氧化還原反應(yīng)，利用淀粉指示液遇碘變藍來判斷反應(yīng)終點，通過計算求得VC的含量，1mL的1mol／L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于0.088 06g的 VC。

取水解后溶液1mL，加入0.5mL的冰醋酸，質(zhì)量濃度為5g／L的淀粉溶液1mL，立即用I2標(biāo)定，平行3次。水解率按下面的公式計算：

式中：v為水解率；c（I2）為碘標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mol／L；V（I2）為消耗碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；m為 MAP的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳水解條件的選擇

實驗考察不同底物濃度、水解時間、反應(yīng)溫度、pH值、加酶量對水解率的影響，選擇最佳的水解條件。

2.1.1 不同底物濃度對水解率的影響

取 MAP 溶液質(zhì)量濃度為 0.43，0.86，1.29，1.72，2.15g／L各5份，每份4mL；分別加入體積分?jǐn)?shù)為5%的PC，在pH為5.5，溫度為37℃下水解2h，計算水解率。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同底物質(zhì)量濃度對水解率的影響

由圖1可以看出，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，水解率呈增大的趨勢。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為0.43g／L時水解率為4.42%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為1.72g／L時，其值達到了21.63%，水解率增加了17.21%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為2.154g／L時，水解率為23.38%，比1.72g／L時僅增加了1.75%，所以選擇底物質(zhì)量濃度1.72g／L為最佳底物濃度。

2.1.2 不同水解時間對水解率的影響

取1.72g／L的 MAP溶液4mL共5份，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的PC，在pH為5.5，溫度37℃下分別水解1，2，3，4，5，8h，計算水解率，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨著時間的延長，水解率不斷增大，當(dāng)時間為4h時其值可達32.33%；但隨后隨著時間的延長，水解率的變化趨于平緩；水解8h時，水解率僅為33.72%。所以選擇最佳的水解時間為4h。

2.1.3 不同pH對水解率的影響

取1.72g／L的 MAP溶液4mL共6份，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的PC，37℃，分別在pH 為3.0，4.0，5.0，5.5，6.0，7.0條件下水解4h，計算水解率，結(jié)果如圖3所示。

圖2 不同時間對水解率的影響

圖3 不同pH對水解率的影響

由圖3可以看出，pH為5.5時水解率最大。這是因為每種酶都有其最合適的pH值范圍，高于或低于這個范圍，酶可能變性或失活。

2.1.4 不同溫度對水解率的影響

取1.72g／L的MAP 4mL共6份，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的PC，調(diào)節(jié)pH為5.5，分別在27，32，37，42，47，52℃下水解4h，計算水解率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度對水解率的影響

由圖4可以看出，在溫度升高的過程中，水解率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在37℃時的水解率最大，可達32.58%，故選擇最佳的水解溫度為37℃。

2.1.5 不同PC量對水解率影響

取1.72g／L的MAP 4mL共6份，調(diào)節(jié)pH為5.5，使 PC 的體積分?jǐn)?shù)分別為2.5%，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，在37℃下水解4h，計算水解率。結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)對水解率的影響

由圖5可以看出，隨著酶濃度的增加，MAP的水解率迅速增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為5%時，水解率可達33.7%，而后緩慢增大，在體積分?jǐn)?shù)為10%時，其值最大可達35.68%，體積分?jǐn)?shù)增加了1倍，水解度僅增大了1.98%，故選擇最佳的體積分?jǐn)?shù)為5%。

綜合上述實驗結(jié)果可以得出：利用PC水解MAP的最佳反應(yīng)條件為：1.72g／L MAP，PC體積分?jǐn)?shù)為5%在pH為5.5，溫度為37℃下水解4h。在此條件下重復(fù)三次試驗，平均水解率為32.64%±0.42%。

2.2 動力學(xué)分析

取底 物 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 0.43，0.86，1.29，1.72，2.15g／L，在選擇出的最適條件下進行水解，計算反應(yīng)速度，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯?/p>

隨著底物質(zhì)量濃度ρs的增加反應(yīng)速率v增大，當(dāng)增加一定程度時，反應(yīng)速率達到最大，因此其反應(yīng)符合米氏方程［10］。利用1／v對1／ρs作圖，擬合出Lineweaver-Burk方程為：

結(jié)果如圖6，圖7所示。

計算得：

km＝25.82g／L，vmax＝126.26g／（L·h），

圖6 反應(yīng)速度與MAP濃度的關(guān)系

圖7 Lineweaver-Buck圖

反應(yīng)動力學(xué)方程為：

3 結(jié)論

實驗優(yōu)化出復(fù)合磷酸酯酶（PC）體外水解Vc磷酸酯鎂（MAP）最佳條件為：底物質(zhì)量濃度1.72g／L，加入1mL PC，在溫度37℃，pH＝5.5下水解4h；在該條件下，MAP可被PC最大程度水解，水解率可達（32.64 ±0.42）%；其 水 解 反 應(yīng) 規(guī) 律 遵 循 v＝126.26ρs／（25.82＋ρs）方程，服用復(fù)合磷酸酯酶腸溶片可以促進MAP水解，進而有效吸收Vc。

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