半胱胺對雞十二指腸中肥大細胞數(shù)量的影響

練高建, 楊 倩

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半胱胺對雞十二指腸中肥大細胞數(shù)量的影響

練高建1, 2, 楊 倩1

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院, 江蘇 南京, 210095; 2.南華大學 實驗動物學部, 湖南 衡陽, 421001)

84只1日齡小公雞, 分為四組, 分別為對照組、新城疫弱毒疫苗免疫組(ND組)、飼喂半胱胺的試驗組(CS組)以及飼喂半胱胺后, 再用新城疫弱毒疫苗進行消化道粘膜的試驗組(CN組). 應用甲苯胺藍染色技術研究了十二指腸中肥大細胞數(shù)量的變化. 結果顯示: 新城疫疫苗首免后第三周, CN組十二指腸中肥大細胞數(shù)量比ND組明顯增加 (< 0.01); 首免后第五周, 各試驗組十二指腸中肥大細胞的數(shù)量均比對照組多, 尤其是CN組, 可能因為個體差異較大, 各組間并無顯著差異. 本試驗的結果提示, 肥大細胞的數(shù)量可能反映了消化道粘膜的免疫水平.

半胱胺; 雞; 十二指; 肥大細胞

肥大細胞(Mast Cell, MC)作為機體的一種重要免疫細胞廣泛分布于人和動物體內(nèi), 它與人類及動物某些變態(tài)反應性疾病、寄生蟲感染以及某些非特異性炎癥和腫瘤性疾病有著密切關系[1]. 近年來, 越來越多的學者認為肥大細胞在機體的免疫功能中起著十分重要的作用[2~5], 其在免疫學中的意義已成為肥大細胞生物學研究的焦點.

生長抑素(Somatostatin,SS)是一種典型的腦腸肽, 除了分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外, 還在所有動物的胃腸道均有分布, 具有廣泛的免疫抑制作用[6]. 試驗發(fā)現(xiàn), 在肥大細胞上存在SS受體[7]. 但肥大細胞在消化道粘膜免疫中發(fā)揮何種作用, 以前未見這方面的報道. 本試驗在飼喂半胱胺的基礎上, 應用新城疫疫苗對雞進行消化道粘膜免疫, 研究了雞小腸中肥大細胞的分布和數(shù)量的變化, 以探討肥大細胞與小腸粘膜免疫功能的關系.

1 材料與方法

1.1 動物免疫

84只1日齡小公雞(AA蛋雞, 購自湯泉種雞場), 隨機分為4組, 每組21只. 自由飲水, 攝食. 8日齡時首次免疫. 第1組為對照組, 每只雞經(jīng)口腔注入Hank’s營養(yǎng)液0.4 mL; 第二組為新城疫免疫組(ND組), 每只雞經(jīng)口腔注入新城疫Ⅳ系弱毒苗(JAAS牧(2000)第003號, 購自江蘇農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所)0.4 mL; 第三組為半胱胺組(CS組), 每只雞經(jīng)口腔注入半胱胺稀釋液0.4 mL; 第四組為半胱胺加新城疫免疫組(CN組), 每只雞先經(jīng)口腔注入半胱胺稀釋液0.4 mL, 此后再經(jīng)口腔注入雞新城疫Ⅳ系弱毒苗0.4 mL. 雞新城疫Ⅳ系弱毒苗的劑量為常規(guī)劑量的4倍. 首免后14天, 第二、第四組再用新城疫Ⅳ系弱毒苗免疫一次, 方法與劑量同首免.

1.2 樣品制備

每組雞首免后分別于21、35及49天各宰殺7只, 采取十二指腸兩段, 4%多聚甲醛中固定24 h, 在25%蔗糖溶液中放置至組織下沉, 再轉移到液氮罐, 最后放至-30℃冰箱保存.

1.3 冰凍切片的制作

應用LEICA CM-1850型號冰凍切片機制作切片, 切片厚12 μm.

1.4 甲苯胺藍染色

試劑: 0.5 mol/L鹽酸配制的0.5%甲苯胺藍, 調pH值至0.5.

染色程序: 甲苯胺藍染色30 min, 充分顯示肥大細胞; 95%酒精分色, 純丙酮脫水兩次, 二甲苯透明, 中性樹膠封片.

1.5 結果統(tǒng)計

切片在Olympus BH-2顯微鏡下觀察, 每張切片選取3個視野記數(shù), 然后對各試驗組雞的肥大細胞數(shù)量通過t檢驗進行統(tǒng)計學分析.

2 結果

2.1 肥大細胞的分布和形態(tài)

在低倍鏡下觀察, 肥大細胞在十二指腸主要分布于腸絨毛固有膜中, 主要呈散點狀分布, 少見成群分布, 形態(tài)多樣, 呈圓形、橢圓形或長梭形(圖1-2). 在高倍鏡下, 可見到肥大細胞的結構特征——胞質內(nèi)充滿異染性顆粒, 聚集較為致密, 顆粒為均質狀. 而肥大細胞在空腸中僅有零星分布.

2.2 肥大細胞的數(shù)量變化

新城疫疫苗首免后第三周, CS組與對照組比較, 差異極顯著(＜0.01); CS組與ND組比較, 差異顯著(＜0.05); CN組與ND組比較, 差異極顯著(＜0.01). 首免后第五周, 各試驗組肥大細胞數(shù)量均比對照組多, 尤其是CN組遠比對照組多, 但可能因為動物個體差異較大, 各試驗組之間無顯著差異. 首免后第七周, 對照組肥大細胞數(shù)量有較大增加, 各試驗組中肥大細胞數(shù)量較接近.

圖1 首免后第三周十二指腸中肥大細胞 (對照組)×200

圖2 首免后第三周十二指腸中肥大細胞 (CN組)×200

圖3 雞十二指腸中肥大細胞數(shù)量的變化

3 討論

肥大細胞是機體內(nèi)一種重要的細胞成分, 能分泌組織胺、5-羥色胺、慢反應物質和肝素等多種生物活性物質, 它與人類及動物某些速發(fā)變態(tài)反應性疾病、寄生蟲感染、生殖、免疫以及某些非特異性炎癥和腫瘤性疾病等有著密切關系. 近年來, 越來越多的學者認為肥大細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要細胞成分, 尤其是被認為是獲得性免疫的啟動子[8]. 許多研究顯示, 肥大細胞與淋巴細胞之間在數(shù)量和分布方面均具有相關性. 例如, 在乳腺癌患者腋下淋巴結的T細胞區(qū)發(fā)現(xiàn)了較多的肥大細胞[4]. 在免疫反應中肥大細胞對T細胞有調節(jié)作用[3,5]. Bulmer等[9]認為外周血T細胞數(shù)量的減少意味著機體細胞免疫功能的下降.

SIgA是動物粘膜免疫主要的效應因子. 隨著細菌的入侵, 當上皮表面免疫活性細胞受到細菌粘附素刺激時, 粘膜局部便產(chǎn)生SIgA和粘液覆蓋在腸粘膜表面形成一層保護層, 以阻止腸道微生物及其毒素分子對小腸粘膜的攻擊. 楊倩等[10, 11]在應用新城疫弱毒苗飲水免疫雛雞和蛋雞的試驗中發(fā)現(xiàn), 雞消化道中均出現(xiàn)大量的SIgA陽性細胞; 作者本人也在對雛雞的試驗中, 得到了同樣的試驗結果. 這些研究表明, 消化道粘膜免疫可以有效地提高局部粘膜免疫力.

本試驗中肥大細胞數(shù)量的變化規(guī)律與SIgA陽性細胞的變化呈現(xiàn)一定的相關性. 在新城疫疫苗首免后第三周, 肥大細胞的數(shù)量出現(xiàn)極顯著的增加, 至首免后第七周, 肥大細胞的數(shù)量下降至與對照組接近, 這與SIgA的變化趨勢是一致的. 既然SIgA陽性細胞數(shù)量的增加意味著雞小腸局部粘膜免疫力的提高, 我們據(jù)此推測, 肥大細胞數(shù)量的增加表明小腸局部免疫功能的增強.

SS對機體免疫具有廣泛的抑制作用. 試驗發(fā)現(xiàn), 在肥大細胞上存在有生長抑素受體[7], SS通過肥大細胞上的SS受體抑制肥大細胞的活動. 本試驗半胱胺組中肥大細胞的數(shù)量顯著的高于對照組, 表明半胱胺耗竭SS后, 雞體內(nèi)的SS水平降低, 解除了肥大細胞增殖的抑制因子, 使肥大細胞的數(shù)量得到了較大幅度的增加. 本試驗中對照組肥大細胞數(shù)量在首免后第三周較少, 但到首免后第七周時, 數(shù)量有了較大幅度的增加, 表明隨著動物的生長發(fā)育和與外界環(huán)境交流的日益增多, 動物的免疫功能得到增強, 逐步建立起自身的免疫屏障.

[1] 劉彥威, 劉娜. 肥大細胞的功能[J]. 中國病理生理雜志, 1993, 9(1): 73-75.

[2] Czarnetzki BM. Release of mediators from purified rat mast cells during phagocytosis[J]. J Immunol, 1982, 15:581-584.

[3] Dexter TM, et al. What are mast cell for[J]. Nature, 1981, 291(5811) :110-111.

[4] Mahapatro RC, et al. Distribution of mast cells in the axillary lymph nodes of breast cancer patients[J]. Cancer, 1979, 44: 592-597.

[5] Thomas WR, et al. Delayed hypersensitivity in mast cell deficient mice[J]. J Immunol, 1983, 130(6): 2565-2569.

[6] Stanisz A M, et al. Differential effects of vasoactive intestinal peptide, substance P, and somatostatin on immunoglobulin synthesis and proliferations by lymphocytes from Peyers patches, mesenteric lymph nodes, and spleen[J]. J Immunol, 1986, 136: 1.

[7] Saavedra Y, Vergara P. Somatostatin inhibits intestinal mucosal mast cell degranulation in normal conditions and during mast cell hyperplasia. Regul Pept, 2003, 111(3): 67-75.

[8] Henz BM, Maurer M,Lippert U et al. Mast cells as initiators of immunity and host defense[J]. Exp Dermatol, 2001, 10(1): 1-10.

[9] Bulmer R et al. Depletion of circulating T lymphocytes in pregnancy[J]. Clin Exp Immunol, 1977, 28: 302-305.

[10] 楊倩, 毛衛(wèi)華, 黃國慶, 等. 巴氏桿菌弱毒苗和雞新城疫弱毒苗飲水免疫蛋雞后分泌型免疫球蛋白A細胞的分布[J]. 中國畜禽傳染病, 1998, 20(6): 340-342.

[11] 楊倩, 毛衛(wèi)華, 汪愛芬. 免疫途徑對雛雞分泌型免疫球蛋白A細胞分布的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 1997, 20(2): 82-86.

Study of the effect of cysteamine on the change of mast cells number in chicken duodenum

LIAN Gao-jian1, 2, YANG Qian1

(1. College of Veterinary Medicine , Nanjing Agric Univ, Nanjing 210095, China; 2. Department of Laboratory Animal Science, Univ of South China, Hengyang 421001, China)

Eight-four 1-day-old cock were divided into control group, ND treated group, CS treated group and the group was immunized with Newcastle disease attenuated vaccine by digestive rout after feeding cysteamine(CN group). Toluidine blue staining method was used to study the change of mast cells number in chicken small intestinal. The results showed that the number of mast cells in duodenum of CN group increased significantly (P<0.01) compared to the group immunizing only with Newcastle disease attenuated vaccine at 3 week after oral immunization; Comparing to the control group at 5 week, the number of mast cells among experiment group increased significantly, though no differences existed among all groups. Our results suggest the number of mast cells might reflect the digestive mucosal immunization.

cysteamine; chicken; duodenum; mast cells

10.3969/j.issn.1672-6146.2012.03.010

Q 352

1672-6146(2012)03-0033-03

2012-08-12

國家自然科學基金項目(30070564)

練高建(1976-), 博士, 講師, 主要從事免疫學相關研究. E-mail: liansue@163.com

(責任編校:譚長貴)