楊蓉娟,許艷蕾,劉雪芹,魏麗莉
(河北省石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北石家莊 050011)
hTERT反義寡核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響
楊蓉娟,許艷蕾,劉雪芹,魏麗莉
(河北省石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北石家莊 050011)
目的探討人端粒酶催化亞基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)反義寡核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響。方法反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染ishikawa細(xì)胞系,采用TRAP-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞端粒酶的活性,觀察其前后的變化。MTT法檢測細(xì)胞活性,流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染細(xì)胞的端粒酶活性及細(xì)胞生長都明顯受到抑制。流式細(xì)胞儀檢測到細(xì)胞凋亡峰,細(xì)胞阻滯于使細(xì)胞停滯在G0~G1期,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,正義寡核苷酸則無此作用。結(jié)論端粒酶hTERT為靶點的反義寡核苷酸可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,且具有促凋亡作用。
端粒,末端轉(zhuǎn)移酶;寡核糖核酸類,反義;細(xì)胞凋亡
子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的三大惡性腫瘤之一,是危害女性健康的常見惡性腫瘤之一,由于激素替代治療的廣泛應(yīng)用,發(fā)病率逐年上升,長期雌激素對子宮內(nèi)膜的持續(xù)作用是引起子宮內(nèi)膜癌的主要危險因素,同時多基因遺傳也參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病。近來端粒-端粒酶機(jī)制成為腫瘤研究的新熱點,端粒酶通過催化端粒合成,保持端粒長度而維持細(xì)胞分裂能力,其活性與細(xì)胞增殖衰老及腫瘤分化、浸潤、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[1]。人端粒酶催化亞基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因是決定端粒酶活性最重要的催化亞基。有研究[2]表明,95%子宮內(nèi)膜癌組織的端粒酶陽性,內(nèi)膜癌的形成可能和端粒酶的異常激活有關(guān)。所謂反義核酸技術(shù)是一種根據(jù)堿基互補(bǔ)原則,用人工合成或生物合成的與特定的基因互補(bǔ)的DNA或RNA片段(或其化學(xué)修飾物)阻斷從基因到蛋白的信息流,從而達(dá)到抑制或阻斷基因表達(dá)的技術(shù)。反義寡核苷酸是一類人工合成或構(gòu)建的重組載體表達(dá)的寡核苷酸片段,通過堿基互補(bǔ)的原理,干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接、加工、翻譯等各個環(huán)節(jié),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化等。我們采用針對hTERT基因的反義寡核苷酸(antisense oligodexynucleotides,ASODN)轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株ishikawa,觀察其對細(xì)胞的生長抑制作用及其機(jī)制,探討子宮內(nèi)膜癌基因治療的新方法。
1.1 hTERT反義寡核苷酸的設(shè)計合成:從基因庫中查出hTERT反義寡核苷酸的堿基序列,設(shè)計出互補(bǔ)于起始密碼子區(qū)的反義片段,選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基,共20個堿基長度為作用的靶序列的ASODN另外合成一段hTERT基因的正義寡核苷酸(sense oligodexynucleotides,SODN)作為對照,每一條鏈均進(jìn)行全硫代修飾。由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,寡核苷酸貯藏于-20℃冰箱中備用,使用時用雙蒸水溶解稀釋成所需濃度。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株購于北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院實驗室,于10%新生牛血清(56℃滅活30min)、100U/mL青霉素、100U/m L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長,0.25%胰酶消化,每周傳代2~3次,實驗所用細(xì)胞保持在對數(shù)生長,分為反義寡核酸組、正義寡核酸組、空白對照組。分別加入含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液并加入不同濃度的寡核苷酸,終濃度分別為2.5、5、10μmol/L,每孔設(shè)3個復(fù)孔??瞻讓φ战M加入等量的培養(yǎng)液。24h更換相應(yīng)濃度的寡核苷酸1次。
1.3 端粒酶活性的測定:端粒酶活性的檢測用PCR-ELISA方法。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取反應(yīng)管,實驗分空白組、反義寡核酸組5μmol/L、正義寡核酸組5μmol/L,分別于轉(zhuǎn)染24、48、72h后按以上方法處理細(xì)胞,取TRAP反應(yīng)模板,各加入45μL反應(yīng)混合物,加入2μL已處理的標(biāo)本,混勻,加入30μL液體石蠟,置25℃水浴保溫30min,在PCR儀上循環(huán),94℃120s,94℃30s,48℃30s,72℃90s,72℃300s循環(huán)35次,循環(huán)結(jié)束后,在微孔中加入雜交反應(yīng)液,再加入擴(kuò)增產(chǎn)物25μL混勻,設(shè)立陰陽及空白對照,置37℃恒溫反應(yīng)60min。然后加入顯色劑A、B。37℃避光顯色10min,加入終止液,終止反應(yīng)。在波長450nm讀取OD值。
1.4 凋亡細(xì)胞和細(xì)胞周期的檢測:采用碘化丙啶(propidumiodide,PI)一步插入法DNA定量熒光染色法,染液中含PI 50ng/m L。上機(jī)檢測前去除樣本中70%乙醇,調(diào)整每份樣品的細(xì)胞數(shù)為1×106/mL,每樣品中加入DNA染液1mL,在40C冰箱中染色30min,以300目篩網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液。應(yīng)用FACS-420型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期,每份樣本檢測1萬個細(xì)胞,每組共檢測3個樣本,重復(fù)3遍。DNA細(xì)胞周期則通過B.D公司提供的相應(yīng)流式細(xì)胞分析軟件,計算出細(xì)胞周期各時相分布百分比,依據(jù)細(xì)胞時相分布計算出細(xì)胞增殖指數(shù),其公式為,PI=[(S+G2M)/(G0+S+G2M)]× 100%。
1.5 細(xì)胞增殖抑制實驗:實驗分為反義組、正義組、空白對照組。分別加入含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液并加入不同濃度的寡核苷酸,終濃度分別為5、10、15μmol/L,每孔設(shè)3個復(fù)孔??瞻讓φ战M加入等量培養(yǎng)液。24h更換相應(yīng)濃度的寡核苷酸1次。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h,在培養(yǎng)皿中按培養(yǎng)液量的10%加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h吸盡培養(yǎng)液,加入與培養(yǎng)液相同量的DMSO,然后振蕩10min,使結(jié)晶充分溶解。立即于自動酶標(biāo)儀492nm波長測定各孔A值。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞的增殖影響:采用MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率可知反義核苷酸組細(xì)胞生長明顯出現(xiàn)抑制,與反義核苷酸作用的濃度和時間呈依賴性。2.5μmol/L反義寡核苷酸作用于細(xì)胞24h其細(xì)胞增殖抑制率為19.11%,與正義組細(xì)胞增殖抑制率6.41%相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨作用時間延長抑制率增加,作用72h其抑制率為42.70%。隨作用濃度的增加其抑制率增加,10μmol/L反義寡核苷酸作用于細(xì)胞72h其增殖抑制率為68.80%,最為顯著,與相同濃度的正義組細(xì)胞增殖抑制率11.40%相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。不同濃度反義寡核苷酸作用于相同時間,反義組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞的生長有明顯抑制作用。見表1。
表1 hTERT反義寡核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖抑制率比較
2.2 ASODN對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞端粒酶活性的影響:ASODN對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用隨著作用時間的延長而增強(qiáng)。在72 h端粒酶活性由0.855±0.025降至0.247± 0.01,抑制作用顯著(P<0.01)。而空白組及正義寡核苷酸組則無明顯抑制作用。
2.3 流式細(xì)胞儀檢測:hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響:用流式細(xì)胞儀檢測到不同濃度的反義核苷酸作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞48h后出現(xiàn)了一群亞G1期細(xì)胞即凋亡細(xì)胞,隨反義核苷酸作用濃度的增加細(xì)胞凋亡率越來越高。2.5~10μmol/L不同濃度反義核苷酸細(xì)胞凋亡率分別為12.46、18.24、26.65,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在同一濃度條件下反義組與正義組及空白組細(xì)胞凋亡率相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而正義組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)hTERT反義核苷酸對細(xì)胞周期有明顯影響,與正義組和空白組相比,反義組細(xì)胞G0~G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞和G2~M期細(xì)胞減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。并呈濃度依賴性。增殖指數(shù)在同一作用濃度,反義組與正義組和空白組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),不同作用濃度,反義組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而正義寡核酸組與空白對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。說明hTERT反義核苷酸明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ishikawa增殖,與細(xì)胞增殖抑制實驗結(jié)果相符合。見表2,3。
表2 hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞周期的影響
表3 hTERT反義寡核苷酸作用于細(xì)胞48h細(xì)胞凋亡率比較
反義核酸技術(shù)是用人工合成的或生物合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段阻斷從基因到蛋白的信息流,以達(dá)到抑制或阻斷基因表達(dá)的生物新技術(shù)。20世紀(jì)80年代早期人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)的一類基因組DNA自發(fā)轉(zhuǎn)錄的反義RNA,通過堿基互補(bǔ)原理與靶RNA(主要是mRNA)配對結(jié)合抑制靶RNA的功能,從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)揮其生物學(xué)作用。隨著研究的深入,反義核酸技術(shù)迅速地發(fā)展起來,反義寡核苷酸其優(yōu)點在于高度靶特異性(堿基互補(bǔ))、設(shè)計多樣、合成容易及高度的局部性和針對性,是常規(guī)藥物的設(shè)計、生產(chǎn)、作用所不能比擬的。
端粒酶由蛋白催化亞基和指導(dǎo)端粒合成的RNA模板組成,即為具有逆轉(zhuǎn)錄酶特性的核蛋白酶[1]。端粒酶的主要組分為:①端粒酶催化亞單位。②RNA分子或端粒酶RNA,它包含了添加端粒酶重復(fù)結(jié)構(gòu)的模板區(qū)。人類hTR已被克隆。③大量的端粒酶相關(guān)蛋白。hTERT是一個最近才被克隆出來的單拷貝基因,其基因組含有逆轉(zhuǎn)錄酶催化區(qū)域高度保守的特異序列。端粒是真核線形染色體末端結(jié)構(gòu),由端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成。它由一端高度保守的重復(fù)序列(TTAGGG)n組成,方向5′—3′,長度5~15kb[2],端粒長度的維持需要端粒酶的激活。自身攜帶模板是端粒酶區(qū)別于一般的純蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶的主要特征之一。國外學(xué)者[3]對乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、食管癌等進(jìn)行廣泛深入研究。實驗說明hTERT基因反義寡核苷酸能以序列特異性方式抑制hTERT的表達(dá),從而抑制端粒酶的活性,也說明了hTERT與端粒酶活性密切相關(guān),hTERT可能是反義核酸治療的另一個非常好的靶基因。hTERT基因的mRNA全部序列,根據(jù)hTERT基因mRNA的序列分析,設(shè)計出互補(bǔ)于起始密碼子區(qū)的反義片段,選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基,共20個堿基長度為作用的靶序列。hTERT ASODN的序列為5′-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3′;另外合成一段hTERT基因的正義寡核苷酸(sense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,SODN)序列作為對照,正義鏈序列為5′-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3′,均經(jīng)計算機(jī)網(wǎng)上檢索證實與hTERT基因以外的已知人類基因無同源性。每一條鏈均對其進(jìn)行全硫代修飾。本實驗結(jié)果顯示,通過MTT發(fā)現(xiàn)2.5μmol/L反義核苷酸作用于96孔板,每孔細(xì)胞濃度1×104/mL后24h后細(xì)胞生長受到抑制,抑制率為其抑制作用并隨作用時間和作用濃度的增加而加強(qiáng);10μmol/L作用72h時抑制率為抑制效果最強(qiáng),與正義組與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而正義組與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,細(xì)胞生長不受影響。說明hTERT反義寡核苷酸能抑制子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞的生長。一些學(xué)者[4]認(rèn)為,端粒酶抑制劑對細(xì)胞的增殖抑制可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。端粒酶活性被抑制導(dǎo)致一些已經(jīng)處于極短的端粒不能維持功能,細(xì)胞染色體發(fā)生斷裂、融合、DNA破壞,觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。研究凋亡最敏感的方法是流式細(xì)胞儀檢測。用FCM檢測細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)反義核苷酸作用于內(nèi)膜癌細(xì)胞48h后可測到凋亡峰,細(xì)胞凋亡時形成的DNA堿基片段于G1期前形成的亞峰,即凋亡峰。而正義組與空白組未見明顯的凋亡峰。細(xì)胞周期是細(xì)胞生長、分裂時,依次經(jīng)過G1、S、G2、M期,一分為二,周而復(fù)始的過程,稱之為細(xì)胞分裂周期。FCM結(jié)果表明反義組細(xì)胞G0~G1期細(xì)胞增多,S期和G2~M期細(xì)胞減少,增殖指數(shù)也隨之減少,并呈濃度依賴性。與正義組和空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。正義組和空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究[6]發(fā)現(xiàn),端粒酶活性是細(xì)胞周期依賴性調(diào)控。端粒酶在DNA復(fù)制期激活,以保持端粒延長,因此,在細(xì)胞周期中,端粒酶活性經(jīng)G1~S期逐漸升高,S期最高,G2~M最低,G0~G1期幾乎處于靜止期。實驗證明hTERT反義寡核苷酸在細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期前引起DNA損傷,使細(xì)胞停滯在G0~G1期,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。
自從1992年美國食品與藥品管理局首次批準(zhǔn)反義藥物用于臨床治療以來,反義技術(shù)成為研究的熱點。大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞依靠端粒酶維持不斷復(fù)制增生,端粒酶抑制劑有可能成為腫瘤治療的新策略。反義技術(shù)應(yīng)用于臨床有明顯的優(yōu)勢,反義寡核苷酸針對性強(qiáng),特異性高,幾乎可以完全阻斷靶基因的翻譯,具有良好的抑制效果。端粒酶應(yīng)用于臨床仍有許多問題有待解決。但是人們依然相信在將來腫瘤治療策略的研究中,端粒酶將起著十分重要的作用。
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(本文編輯:劉斯靜)
R737.33
B
1007-3205(2012)07-0832-04
2012-04-17;
2012-05-20
楊蓉娟(1977-),女,河南林州人,河北省石家莊市第四醫(yī)院主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士,從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。
10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.033