豬精液冷凍和解凍技術(shù)

楊 露，張全生，鄧澤濤

（重慶市種畜場(chǎng)，重慶 400020）

精液冷凍保存是人工授精技術(shù)的一項(xiàng)重大革新，自冷凍精液在牛開(kāi)始試驗(yàn)成功以來(lái)，迄今已40多年，利用冷凍精液解凍后進(jìn)行輸精已成為許多國(guó)家作為人工授精的主要方法。目前，有些國(guó)家的精液冷凍技術(shù)發(fā)展到嶄新的工廠化階段。牛的冷凍精液在生產(chǎn)中得到了大力推廣和應(yīng)用。而豬的冷凍精液至今仍處于實(shí)驗(yàn)階段，究其主要原因是解凍后精子復(fù)蘇率較低，異常精子多，受胎率低于正常水平。

1 精液的冷凍

1.1 冷凍的原則

冷凍過(guò)程中的精細(xì)胞不但要對(duì)保存溫度（-196 ℃）有耐受能力，而且要能經(jīng)受從射精時(shí)肌體體溫到保存時(shí)超低溫度的變化，且活率不能過(guò)度降低。因此，后者比前者顯得更重要，每種細(xì)胞都有它理想的冷凍與解凍速度。第一，冷凍速率太慢時(shí)，與冷凍保護(hù)劑接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，精子容易受冷凍保護(hù)劑的化學(xué)損傷作用而死亡或遭受破壞。第二，冷凍速率過(guò)快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液體易導(dǎo)致結(jié)冰現(xiàn)象，對(duì)細(xì)胞造成物理或化學(xué)傷害。解凍原理恰好相反。

表1 豬精液常用冷凍劑稀釋液成分表

1.2 稀釋液的配制原則

第一，配制稀釋液所使用的一切用具，必須經(jīng)認(rèn)真清洗和嚴(yán)格消毒。第二，稀釋液要現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮，經(jīng)密封、消毒的稀釋液，允許在0～5 ℃的冰箱中保存1周。但卵黃、抗生素、酶、激素等有生物活性的物質(zhì)必須在用前時(shí)臨時(shí)添加。第三，稀釋用水應(yīng)為蒸餾水或重蒸餾水，要求保持新鮮、中性。 第四，配制稀釋液所用的化學(xué)制劑要純凈，一般要求化學(xué)純或分析純；稱量要準(zhǔn)確無(wú)誤，經(jīng)充分溶解、過(guò)濾后進(jìn)行消毒（隔水煮沸或蒸氣消毒）。第五，卵黃和奶類成分要求新鮮、無(wú)污染、無(wú)雜質(zhì)。第六，抗生素等有生物活性的物質(zhì)，必須在稀釋液冷卻至室溫時(shí)按計(jì)量準(zhǔn)確加入，以免失去活性和對(duì)精子造成不良影響。

1.3 凍精顆粒的制備

用手握法采精，開(kāi)始射出的清亮液體部分應(yīng)棄去，這部分液體是尿道球腺的分泌物，不含精子，用來(lái)沖洗尿生殖道的積尿。因此，開(kāi)始射出的20 mL液體不應(yīng)接取。當(dāng)射出乳白色液體時(shí)，即為濃精液，要用集精杯收集起來(lái)。對(duì)于采集的精液，經(jīng)紗布過(guò)濾后，對(duì)鮮精進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè),選擇活率達(dá)80%以上,精子密度在2.0億～3.0億個(gè)/mL以上的精液用于冷凍。

為保護(hù)精子和減少凍害作用，在冷凍前應(yīng)當(dāng)用冷凍稀釋液對(duì)精液進(jìn)行稀釋。常用的稀釋法有一次稀釋法、二次稀釋法。一次稀釋法是將采出的精液和含甘油（甘油作用是增強(qiáng)精子抗凍能力，但濃度過(guò)高對(duì)精子有毒害作用）的同溫稀釋液按比例要求一次性添加；二次稀釋法是將采出的精液先被不含甘油的第一稀釋液稀釋后再用含甘油的第二稀釋液做二次稀釋，以減少甘油對(duì)豬精子的有害作用。

以二次稀釋法為例：將采集的精液在常溫的等溫條件下，用不含甘油的成分的第一稀釋液（見(jiàn)表1），根據(jù)精液品質(zhì)按比例稀釋。稀釋后的精液先緩慢降溫（用紗布包裹）至15 ℃維持4 h，再?gòu)?5 ℃經(jīng)1 h降至5 ℃，然后用等溫的含甘油的成分第二稀釋液（見(jiàn)表1）進(jìn)行稀釋。稀釋后用液氮熏蒸法制作凍精顆粒。利用廣口液氮罐，以聚四氟乙烯板作為冷凍面，要使承接精液的表面與液氮面保持一定的距離（1～2 cm）。在滴凍的過(guò)程中，要維持-80～-100 ℃的溫度。滴凍前要將經(jīng)平衡的精液充分混勻。并檢查精子的活率。 滴要迅速，顆粒要均勻，每毫升經(jīng)過(guò)稀釋的精液滴10粒左右為宜。滴凍時(shí)間控制在60 s內(nèi)完成，加蓋熏蒸平衡3～4 min后待所有顆粒已凍結(jié)，經(jīng)抽樣檢查（一般隨機(jī)抽取2粒），解凍活率在0.3以上者，即可裝于紗布袋中，經(jīng)標(biāo)記后在液氮中保存。

2 精液的貯存

豬的冷凍精液是以液氮做冷源進(jìn)行貯存的，需要時(shí)可隨時(shí)取出。液氮是空氣中的氮?dú)饨?jīng)壓縮、分離形成的一種無(wú)色無(wú)味無(wú)毒的液體,沸點(diǎn)溫度為-195.8 ℃。在常溫下,液氮沸騰,吸收空氣中的水氣形成白霧。液氮具有很強(qiáng)的揮發(fā)性,當(dāng)溫度升至18 ℃時(shí),其體積可以膨脹680倍。此外,液氮是一種不活潑的液體,滲透性差,無(wú)殺菌能力,但是在-196 ℃的超低溫可使多數(shù)細(xì)菌和病毒停止繁殖。為防止溫度變化對(duì)精液品質(zhì)的影響，取放動(dòng)作要迅速，盡量減少在空氣中停留的時(shí)間。從貯存容器中提取冷凍精液時(shí)，精液不應(yīng)超過(guò)液氮容器的頸基部，避免因溫度的回升造成精液解凍活率的下降。

3 精液的解凍

3.1 解凍原理

凍精的解凍過(guò)程同冷凍過(guò)程一樣，必須通過(guò)精子冰晶化的危險(xiǎn)溫度區(qū)，才不致于對(duì)精子細(xì)胞造成損傷。實(shí)驗(yàn)證明，解凍速率比冷凍速率對(duì)精子質(zhì)量的影響更大（Eriksson等，2000）。因此，解凍速率是影響精子質(zhì)量及存活的一個(gè)重要因素。而影響解凍速率的關(guān)鍵是解凍溫度的控制。

3.2 解凍方式及步驟

3.2.1 解凍方式

冷凍精液的解凍溫度，有低溫冰水解凍（0～5 ℃）、溫水解凍（30～40 ℃）、高溫解凍（50～70 ℃）幾種。實(shí)踐中，豬的精液解凍溫度以50～60 ℃效果較好。以干解凍為例，將滅菌試管置于50～60 ℃水中恒溫后，投入若干精液顆粒（一般是一個(gè)輸精劑量），搖動(dòng)至融化，同時(shí)加入1 mL 20～30 ℃解凍液（5 g葡萄糖、0.3 g二水檸檬酸鈉、0.1 g乙二胺四乙酸鈉，100 mL蒸餾水）進(jìn)行解凍。

3.2.2 精子活率及其形態(tài)觀察

解凍后，立即取1～2滴精液滴在事先預(yù)熱的載玻片上，置于顯微鏡下37 ℃恒溫載物臺(tái)上，測(cè)定活率,活力在0.3以上者才能用于輸精。在實(shí)踐生產(chǎn)中，由于操作等多方面原因，經(jīng)過(guò)冷凍和解凍處理后的精液品質(zhì)往往不理想，為了鑒定稀釋液和精液處理后的效果，保證較好的受精率，在測(cè)定精子活率的同時(shí)還要參考以下幾個(gè)指數(shù)。

1）精子存活時(shí)間和存活指數(shù)的檢查：將精液注入盛有1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.9%檸檬酸鈉溶液的試管中，放入37 ℃恒溫水箱內(nèi)記錄精子存活時(shí)間。開(kāi)始每隔1 h觀測(cè)1次活率，當(dāng)精子活率降低一半時(shí)，間隔30 min觀測(cè)1次活率，直到精子全部死亡，記錄精子存活時(shí)間。精子存活時(shí)間越長(zhǎng)，指數(shù)越大，說(shuō)明精子生活能力越強(qiáng)，品質(zhì)越好。

2）精子畸形率檢查：精子畸形主要為頭部畸形 (長(zhǎng)形頭、梨形頭、巨形頭等)和尾部畸形(尾部卷曲、彎曲)?？蓪⒕旱沃瞥赡ㄆ苯釉?00倍以上顯微鏡下觀察，每個(gè)切片記數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算出畸形精子百分率即為精子畸形率。品質(zhì)優(yōu)良的豬精液畸形率不超過(guò)18%。

3）精子頂體異常率：精子頂體異常有膨脹、缺損、部分脫落、全部脫落等數(shù)種?？蓪⒔鈨龊蟮木旱斡谳d玻片上，用藍(lán)墨水染色法染色，在1 000倍油鏡下觀察精子形態(tài)，觀察200個(gè)以上精子中頂體異常數(shù)，計(jì)算出頂體異常率。正常情況下，豬頂體異常率平均為2.3%，如果超過(guò)4.3%，將會(huì)直接影響受精率。

4 存在的問(wèn)題和應(yīng)用前景

豬精液冷凍和解凍技術(shù)目前還不成熟，一方面是由于與之配套的豬精液冷凍過(guò)程中的冷凍-解凍機(jī)理、精子損傷機(jī)理、精子內(nèi)部組成物質(zhì)的變化規(guī)律及分子機(jī)制等諸多方面尚不完全清楚；另一方面實(shí)際操作過(guò)程中也存在同一種公豬不同時(shí)期精液品質(zhì)存在差異，并且稀釋液添加量的不同、解凍人員操作規(guī)范上存在的差異性等都會(huì)在一定程度上影響豬精液的品質(zhì)。但是豬精液冷凍的研究具有重要研究意義，應(yīng)用前景廣泛。從理論上通過(guò)篩選適宜的豬凍精顆粒的解凍溫度，可以明顯提高精子的凍后復(fù)蘇率、活率及解凍后精子的受精能力。該研究在建立優(yōu)良品種豬的種質(zhì)資源，保存品種種質(zhì)資源具有不可替代的作用，在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)優(yōu)良種豬精液的儲(chǔ)運(yùn)和實(shí)際使用效果以及生產(chǎn)性能的發(fā)揮也會(huì)具有十分顯著的促進(jìn)作用。