Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺腫瘤組織及血清中的表達及臨床意義

王建功，胡萬寧*，王曉紅，李義慧，劉衛(wèi)東

（1.河北省唐山市人民醫(yī)院頭頸外科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市人民醫(yī)院放射化療科，河北唐山 063000）

Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺腫瘤組織及血清中的表達及臨床意義

王建功1，胡萬寧1*，王曉紅2，李義慧2，劉衛(wèi)東2

（1.河北省唐山市人民醫(yī)院頭頸外科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市人民醫(yī)院放射化療科，河北唐山 063000）

目的探討Wnt5a、細胞周期蛋白B2（cell cycle protein B2，CyclinB2）在甲狀腺癌患者組織及血清中的表達及其臨床意義。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應方法檢測Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺癌患者（30例）及甲狀腺良性疾病患者（30例）手術切除組織及外周血清中的表達。結果Wnt5a及CyclinB2在甲狀腺癌組織及血清中高表達；差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論Wnt5a、CyclinB2可作為鑒別診斷甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性病變的重要參考指標，聯(lián)合檢測效果更好，更有實用價值。

甲狀腺腫瘤；Wnt蛋白質(zhì)類；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

目前Wnt信號途徑與腫瘤的關系，越來越受廣大學者的關注。Wnt5a基因是Wnt家族中的重要成員之一。Wnt5a持續(xù)表達或過度表達在癌癥發(fā)生中起著十分重要的作用。Wnt5a基因通過影響腫瘤細胞的增殖、分化及侵襲與轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮作用。細胞周期蛋白B2（cell cycle protein B2，CyclinB2）首先在非洲蟾蜍卵中被發(fā)現(xiàn)，CyclinB2 mRNA異常表達與腫瘤細胞的增殖有關［1］。由于成年人體內(nèi)絕大部分細胞，除了原始干細胞、生殖細胞和活化的淋巴細胞外，均不表達CyclinB2，而在部分腫瘤中均可以檢測到CyclinB2 mRNA，這一特性使得CyclinB2成為腫瘤細胞的一種理想標志。本實驗應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）技術檢測Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺癌、甲狀腺良性腫瘤組織及血清中的表達，旨在探討其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集唐山市人民醫(yī)院頭頸腫瘤科2008年1—6月手術切除的甲狀腺瘤組織60例，液氮冷凍保存。其中乳頭狀甲狀腺癌組織（A組）30例，男性9例，女性21例，年齡21～69歲，平均46.3歲；甲狀腺良性疾病組織（B組）30例（甲狀腺瘤15例，結節(jié)性甲狀腺腫15例），男性11例，女性19例，年齡33～72歲，平均47.4歲。全部組織標本均經(jīng)3位病理科醫(yī)師會診。所有患者均在術前采集了外周靜脈血，離心提取血清。

1.2 實驗方法：采用Trizol（Biochain Institute，Inc）提取組織及血清中總RNA，NanoDrop ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，隨機引物逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，cDNA合成后通過熒光定量PCR系統(tǒng)進行PCR反應，同一個標本的目的基因與內(nèi)參基因（18s RNA）同批擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的 Ct值（cyde threshdd，表示擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)）與其內(nèi)參量的比值求出各個組織標本所含該基因的相對表達量。應用Primer5.0分別設計基因Wnt5a、CyclinB2及內(nèi)參18s的引物序列和配套的探針序列，引物及探針序列 如 下， Wnt5a 上 游 引 物， 5′ -ACTGCAGCACTGTGGATAACAC-3′，下游引物，5′-CGCTCACCGCGTATGTGAAG-3′，探針序列，5′-ATGCAGATAGGCAGCCGCGAGA-3′；CyclinB2上游引物，5′-CACAGGATACACAGAGAATG-3′，下游引物，5′-CTTGATGGCGATGAATTTAG-3′，探針序列，5′-ATTGGAAGTCATGCAGCACATGG C-3′，所有 Taqman探針的5′端標記 FAM，3′端標記TAMRA。上述引物和探針均由北京雅康博生物科技有限公司設計合成。

1.3 統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺癌組織、甲狀腺良性疾病組織及血清中均有表達，甲狀腺癌中的表達明顯高于在甲狀腺良性疾病中的表達（P＜0.05），見表1，2。

表1 Wnt5a在甲狀腺癌和甲狀腺良性疾病中的表達比較Table 1 The expression of Wnt5a in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

表1 Wnt5a在甲狀腺癌和甲狀腺良性疾病中的表達比較Table 1 The expression of Wnt5a in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

*P＜0.05 vs group A by t test

Groups Wnt5a Serum Tissue A 1 547.14±422.69 1 026.68±171.47 B 614.05±52.93* 406.29±119.29*

表2 CyclinB2在甲狀腺癌和甲狀腺良性疾病中的表達比較Table 2 The expression of CyclinB2 in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

表2 CyclinB2在甲狀腺癌和甲狀腺良性疾病中的表達比較Table 2 The expression of CyclinB2 in different thyroid cancer and thyroid benign diseases（±s）

*P＜0.05 vs group A by t test

Groups CyclinB2 Serum Tissue A 2 010.01±363.73 1 427.17±546.90 B 740.61±260.47* 707.05±165.43*

以Wnt5a相對表達量＞1 000作為檢測甲狀腺癌的診斷點，靈敏度為91.6%，特異度為90.0%（χ2=24.75，P＜0.01）。以CyclinB2相對表達量＞1 400作為檢測甲狀腺癌的診斷點，靈敏度為100%，特異度為93.7%（χ2=52.50，P＜0.01）。

Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺癌組織中表達呈高度相關性（r=0.967，P＜0.01）。Wnt5a、CyclinB2的表達與性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結轉(zhuǎn)移等均無關（P＞0.05）。

3 討 論

近年來出現(xiàn)較多與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有關的腫瘤標志物［1］，而理想的腫瘤標志物應該具有特異度和靈敏度高、可信度高、穩(wěn)定性強的特點。Wnt信號途徑的成員有癌基因，也有抑癌基因，它們通過遺傳或非遺傳途徑在人類許多常見惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著極其重要的作用［2］。目前Wnt信號途徑與腫瘤的關系，越來越受廣大學者的關注。Wnt5a作為非經(jīng)典通路的啟動基因持續(xù)表達或過度表達影響腫瘤細胞的增殖、分化及侵襲與轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮作用。Wnt5a基因是Wnt家族中的重要成員之一，定位于染色體的3p14～p21區(qū)，Wnt5a起始的631個堿基對包含了很強的啟動子活性，該基因編碼富含半胱氨酸的生長因子，參與生長和分化過程中的細胞間信號傳遞［3］。有研究［4］表明在分化的甲狀腺癌中，Wnt5a通過對抗經(jīng)典的Wnt信號途徑而發(fā)揮抑制腫瘤基因活性。當細胞表面表達Frizzled 4和低密度脂蛋白相關受體相關蛋白5受體時，Wnt5a竟可穩(wěn)定β-catenin，并活化經(jīng)典通路中β-catenin下游的靶基因。最終導致細胞阻滯在G2/M期［5］。CyclinB2是細胞周期G2/M期的重要調(diào)節(jié)因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CyclinB2在肺癌、乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用［6-7］。當CyclinB2異常表達時，則失去了對DNA突變監(jiān)控能力，使細胞過度增殖、分化受阻而發(fā)生腫瘤。CyclinB2是CyclinB的一個亞型，在多種腫瘤中都過度表達［8］，與腫瘤某些特異性生物學行為密切相關；CyclinB2 mRNA異常表達與腫瘤細胞的增殖有關。惡性腫瘤細胞通過啟動CyclinB2基因的表達促進惡性增殖。本實驗結果顯示，Wnt5a、CyclinB2在甲狀腺良性疾病組織為正常表達，分化型甲狀腺癌中的表達明顯高于甲狀腺良性組織中的表達。提示 Wnt5a及CyclinB2異常表達在甲狀腺癌發(fā)生中起到重要作用。Wnt5a、CyclinB2可能作為癌基因參與了這一過程，也印證了上述理論的合理性。由此我們認為，甲狀腺癌的發(fā)生與Wnt5a、CyclinB2的過度表達密切相關，是多種癌基因激活協(xié)同作用的結果。

本實驗結果表明，Wnt5a及CyclinB2的陽性表達率與甲狀腺癌患者性別、細胞分化程度、臨床分型及分期無相關性。從而表明Wnt5a及CyclinB2陽性表達可能是甲狀腺癌發(fā)生的早期分子事件，具有早期診斷價值。此外，由于成年人體內(nèi)絕大部分細胞，除了原始的干細胞、生殖細胞和活化的淋巴細胞外，均不表達Cyclin B2，而在部分腫瘤中均可以檢測到CyclinB2 mRNA，這一特性也使得CyclinB2有望成為腫瘤細胞的一種理想標志。本實驗結果提示，Wnt5a、CyclinB2無論是在甲狀腺組織還是在外周血血清中，其檢測結果與病理結果相吻合。尤其是聯(lián)合檢測Wnt5a、CyclinB2在外周血中的表達具有很好的臨床應用前景，可以作為診斷學指標。

［1］TEN YY，ELECTRON K，BRUCE M.Cell surface and secreted protein ofhoman thyroid cancercelllinesrevealdistinct glyloprotein patterns［J］.Proteom Res，2009，8（8）：3958-3968.

［2］YAMAMOTO H，OUE N，SATO A，et al.Wnt5a signaling is involved in the aggressiveness of prostate cancer and expression of metalloproteinase［J］.Oncogene，2010，29（14）：2036-2046.

［3］MCDONALD SL，SILVER A.The opposing roles of Wnt-5a in cancer［J］.Br J Cancer，2009，101（2）：209-214.

［4］WEND P，HOLLAND JD，zIEBOLD U et al.Wnt signaling in stem and cancer stem cells［J］.Semin Cell Dev Biol，2010，21（8）：855-863.

［5］DVORY-SOBOL H，COHEN-NOYMAN E，KAzANOV D，et a1.Celecoxib lea-ds to G2/M arrest by induction of p21 and down-regulation of cyclinBl expression in a p53-independent manner［J］.Eur J Cancer，2006，42（3）：422-426.

［6］LUCKI NC，SEWER MB.Genistein stimulates MCF-7 breast cancer cell growth by inducing acid ceramidase（ASAH1）gene expression［J］.J Biol Chem，2011，286（22）：19399-19409.

［7］MO ML，CHEN z，LI J，et al.Use of serum circulating CCNB2 in ca-ncer surveillance［J］.Int J Biol Markers，2010，25（4）：236-242.

［8］MEDREK C，LANDBERG G，ANDERSSON，et al.Wnt-5a-CKIα signalingpromotesβ -catenin/E -cadherin complex formation and intercellularadhesion in human breast epithelial cells［J］.J Biol Chem，2009，284（16）：10968-10979.

（本文編輯：趙麗潔）

THE EXPRESSION AND CLINCAL SIGNIFICANCE OF Wnt5a AND CYCLINB2 IN THE THYROID GLAND CANCER TISSUE AND BLOOD SERUM

WANG Jiangong1，HU Wanning1*，WANG Xiaohong2，LI Yihui2，LIU Weidong2
（1.Department of Head and Neck Surgery，the People′s Hospital of Tangshan City，Hebei Province，Tangshan 063000，China；2.Department of Radiotherapy，the People′s Hospital of Tangshan City，Heibei Province，Tangshan 063000，China）

Objective To explore the expression of Wnt5a and CyclinB2 in the thyroid gland cancer and their relationship so as to provide a theoretical basis for the clinical diagnosis and treatment of the disease.MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to detect the expression of Wnt5a and CyclinB2 in 30 cases of papillary thyroid cancer tissue and serum and 30 case of benign thyroid tumor tissue and serum.ResultsWnt5a and CyclinB2 were highly expressed in thyroid cancer tissue and serum with significant differences（P＜0.05）.ConclusionWnt5a and CyclinB2 can be used as important indices for differential diagnosis of thyroid papillay cancer and thyroid benign lesion.The combined detection of Wnt5a and CyclinB2 is better and more valuable.

thyroid neoplasms；Wnt proteins；reverse transcriptase polymerase chain reaction

R736.1

A

1007-3205（2012）11-1268-03

2012-03-31；

2012-05-19

王建功（1975-），男，河北唐山人，河北省唐山市人民醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事頭頸外科疾病診治研究。

*通訊作者。Email：renmingyiyuanhu@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.011