大蒜素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖的影響

鐘燕玲，李衛(wèi)真，趙素梅，劉春生，張永云*

（1.大理學(xué)院云南省紅會(huì)教學(xué)醫(yī)院，昆明 650021；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中心，昆明 650201；3.云南省第一人民醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032）

鐘燕玲1，李衛(wèi)真2，趙素梅2，劉春生3，張永云2*

（1.大理學(xué)院云南省紅會(huì)教學(xué)醫(yī)院，昆明 650021；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中心，昆明 650201；3.云南省第一人民醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032）

目的：觀察大蒜素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞SLC-89增殖的影響。方法：不同濃度的大蒜素與SLC-89細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，運(yùn)用MTT法測定大蒜素的IC50。將IC50、IC50/2、IC50/4劑量的大蒜素與SLC-89細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，運(yùn)用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-酶聯(lián)免疫吸附法分別測定細(xì)胞端粒酶活性，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞PCNA的表達(dá)率。加入等量生理鹽水共培養(yǎng)作為對(duì)照組。結(jié)果：大蒜素能抑制SLC-89細(xì)胞的增殖，其IC50為79.8μg/mL，IC50和IC50/2劑量的大蒜素能顯著抑制SLC-89細(xì)胞端粒酶的活性，IC50、IC50/2、IC50/4劑量的大蒜素都能顯著抑制SLC-89細(xì)胞PCNA的表達(dá)。結(jié)論：大蒜素能抑制SLC-89細(xì)胞的增殖，其PCNA的表達(dá)比端粒酶活性更容易受到下調(diào)。

大蒜素；端粒酶活性；PCNA；SLC-89細(xì)胞；肺腺癌

肺癌是發(fā)病率和死亡率均很高、嚴(yán)重危害人類身體健康的惡性腫瘤。目前，化療仍然是肺癌治療的主要手段之一，但強(qiáng)烈的副作用常常使患者望而生畏，因此，研究探討非化療藥物治療癌癥具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。大蒜是人們?nèi)粘Ｉ钪胁妥郎系某Ｓ谜{(diào)味品，其主要有效成分就是大蒜素（Allicin），具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗菌、抗癌等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，從而受到人們的關(guān)注〔1〕。云南省宣威縣是我國肺癌的高發(fā)地區(qū)之一，為了有效提高宣威縣肺癌的防治水平，本課題組多年前研究建立了云南省宣威縣肺腺癌細(xì)胞系SLC-89，為肺癌的研究奠定了重要基礎(chǔ)〔2〕。本研究觀察了大蒜素對(duì)云南宣威肺腺癌細(xì)胞系SLC-89的影響，為臨床上肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料SLC-89細(xì)胞由本課題組傳代保株。大蒜素為上海和風(fēng)制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格15 mg/mL。RPMI-1640培養(yǎng)液為Hyclone公司生產(chǎn)，新生牛血清（Newborn cattle serum，NCS）為invitrogen公司生產(chǎn)，四唑氮藍(lán)（MTT）為Sigma公司生產(chǎn)，端粒酶檢測試劑盒為德國Boehringerr Manheiman公司生產(chǎn)。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）流式抗體PCNA-FITC為NeoMarkers公司生產(chǎn)。PCR擴(kuò)增儀為美國MJ公司的PTC-100型熱循環(huán)儀。吸光度值（A）采用美國的DYNEXREVELATION312型酶標(biāo)儀測定。顯微鏡為NIKON倒置相差顯微鏡。

1.2IC50的測定按照文獻(xiàn)〔2〕的方法培養(yǎng)SLC-89細(xì)胞。將15 mg/mL的大蒜素用生理鹽水稀釋，參照文獻(xiàn)〔3〕報(bào)道的MTT方法進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)并測定大蒜素72 h的IC50。即不同濃度的藥液與細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，加入MTT并測定相應(yīng)吸光度值，觀察大蒜素對(duì)細(xì)胞的抑制作用，求出不同濃度藥物作用下相應(yīng)的細(xì)胞抑制率，并用SPSS10.0系統(tǒng)軟件作回歸分析，算出大蒜素的IC50。

1.3 細(xì)胞處理在體外37℃、5%CO2的條件下，采用10%NCS的RPMI-1640培養(yǎng)液飼養(yǎng)SLC-89細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成4.5×104/mL的懸液接種于50 mL小方瓶中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，分別加入生理鹽水和實(shí)驗(yàn)藥液，實(shí)驗(yàn)組又分為高、中、低三個(gè)濃度組，高濃度組按測定的IC50劑量加入大蒜素溶液，中濃度組按IC50的1/2劑量加入大蒜素溶液，低濃度組按IC50的1/4劑量加入大蒜素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后消化收集細(xì)胞測試以下指標(biāo)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。

1.4 端粒酶活性的測定按照文獻(xiàn)〔3〕報(bào)道的方法進(jìn)行端粒酶活性測定。即消化收集細(xì)胞，裂解后取3 μL細(xì)胞提取液進(jìn)行TRAP-ELISA反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為：25℃延伸引物30 min，94℃滅活端粒酶10 min，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與20μL變性液室溫下反應(yīng)10 min，再加入225μL雜交液混勻。ELISA反應(yīng)板的每孔加入100μL雜交產(chǎn)物，37℃下作用2 h。洗凈后加入100μL Anti-DIG-POD工作液反應(yīng)30 min，洗凈后加入100μL TMB液顯色反應(yīng)20 min，加入100μL終止液終止反應(yīng)。在450 nm/690 nm下測定吸光度值。

1.5PCNA表達(dá)率的測定PCNA的測定參照課題組建立的方法〔3〕進(jìn)行，即消化收集的細(xì)胞用PBS緩沖液漂洗后，4%甲醛固定10 min，0.5%TritonX-100破膜10 min。然后用PBS漂洗3遍，加入抗人PCNAFITC流式抗體反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次，流式細(xì)胞儀檢測分析PCNA的表達(dá)率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行回歸分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對(duì)SLC-89細(xì)胞增殖的影響為了觀察大蒜素對(duì)LC-89細(xì)胞增殖的影響，將不同濃度的大蒜素溶液與SLC-89細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示：大蒜素對(duì)SLC-89細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞收縮，由原來的梭形變?yōu)閳A形，甚至有部分細(xì)胞脫落崩解，變成顆粒狀無定型的碎片，MTT代謝率顯著降低。SLC-89細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，求出的回歸方程為Y=0.005X+0.101，大蒜素的IC50值為79.8μg/mL。

2.2 大蒜素對(duì)SLC-89細(xì)胞端粒酶活性的影響不同濃度大蒜素溶液與SLC-89細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，PCR-ELISA法檢測細(xì)胞的端粒酶活性，結(jié)果顯示：高濃度及中等濃度劑量的大蒜素能顯著抑制SLC-89細(xì)胞端粒酶的活性，而低濃度劑量的大蒜素對(duì)SLC-89細(xì)胞端粒酶活性的影響沒有顯著性差異。見表1。

2.3 大蒜素對(duì)SLC-89細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響不同濃度大蒜素溶液與SLC-89細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，流式檢測分析結(jié)果顯示：高濃度、中等濃度及低濃度劑量的大蒜素都能顯著抑制SLC-89細(xì)胞PCNA的表達(dá)。見表1。

表1 不同濃度的大蒜素對(duì)SLC-89細(xì)胞的影響

3 討論

作為一種重要的腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物，端粒酶一直作為腫瘤治療的主要靶點(diǎn)來廣泛研究。我們先前的研究證明：取材于云南宣威這一肺癌高發(fā)區(qū)患者而建立的細(xì)胞SLC-89，是深入研究這一地區(qū)肺癌防治的最佳材料，與眾多腫瘤細(xì)胞一樣其端粒酶也是陽性表達(dá)，與常用化療藥物共培養(yǎng)后可以通過調(diào)控端粒酶等基因的表達(dá)而抑制其增殖生長〔3〕。但順鉑的使用，存在著明顯的毒副作用。尋找低毒或無毒的治療方法或治療藥物一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的重要努力方向。

大蒜是人們常用的調(diào)料蔬菜，其球莖中含有的硫鍵化合物，即大蒜素，具有抗癌功效，其機(jī)制包括抗氧化〔4〕、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕和抑制細(xì)胞增殖〔6〕。本研究表明：加入42.12μg/mL的大蒜素可在體外抑制云南宣威肺腺癌SLC-89細(xì)胞的增殖生長并顯著降低端粒酶活性，抑制PCNA的表達(dá)，這個(gè)結(jié)果與鼻咽癌〔7〕的研究報(bào)道類似，也與我們先前關(guān)于順鉑的研究結(jié)果〔3〕類似。研究提示：云南宣威肺腺癌這一地區(qū)多發(fā)病與其它惡性腫瘤一樣，其作用機(jī)制都與端粒酶和PCNA的表達(dá)有關(guān)。但本研究顯示：加入21.06μg/mL的低濃度的大蒜素只能顯著抑制SLC-89細(xì)胞PCNA的表達(dá)，不能顯著降低端粒酶的活性，這說明SLC-89細(xì)胞的生長增殖更容易受到大蒜素的影響。大蒜素也被證明可以抑制肺癌H460細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡〔8〕，還可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖及PCNA的表達(dá)〔9〕，說明其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能是廣泛存在的。正常機(jī)體細(xì)胞的凋亡和增殖受多種因素影響，其中端粒酶和PCNA就是兩個(gè)重要的調(diào)控因素。端粒酶是一種RNA依賴的DNA聚合酶，在維持細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用。降低端粒酶活性、破壞端粒的穩(wěn)定可使細(xì)胞走向死亡。PCNA是一種DNA聚合酶的輔助蛋白，是DNA合成不可缺少的因子，是反映細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)。研究證明：腫瘤端粒酶活性與PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)，二者都是判斷腫瘤惡性程度的重要標(biāo)志物〔10〕，但本研究結(jié)果提示：端粒酶與PCNA對(duì)藥物的敏感性不一致。盡管大蒜素的確切抗癌機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究，但筆者認(rèn)為：大蒜素可以通過食療方式治療惡性腫瘤，本身就具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，臨床研究〔11〕證明：大蒜素與順鉑聯(lián)合使用，還可減輕其毒副反應(yīng)。此外，大蒜素還可顯著增強(qiáng)機(jī)體的免疫耐受能力，提高化療效果和患者的生存質(zhì)量〔12〕。這對(duì)于放化療后的腫瘤患者來說，大蒜素的使用更是一種有益的補(bǔ)充，大蒜作為一種餐桌上的調(diào)料，值得推廣使用。

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〔2〕陳志龍，朱玉琨，閻偉，等.云南宣威肺腺癌細(xì)胞系SLC-89的建立及其生物學(xué)特性〔J〕.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1992，14（3）：119-121.

〔3〕龐榮清，劉春生，潘興華，等.順鉑對(duì)人肺腺癌細(xì)胞SLC-89作用的機(jī)理探討〔J〕.中國肺癌雜志，2003，6（3）：469-472.

〔4〕Arranz AI,Haza A,Garca.Protective effectsoforganosulfurcom pounds towards N-nitrosaminc induced DNA damage in the single-cell gelelectrophoresis（SCGE）/HepG2 assay〔J〕. Food and Chemical Toxicology,2007（45）:1662-1669.

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〔12〕梁笑傾，譚布珍.大蒜素對(duì)提高腫瘤細(xì)胞免疫功能的研究進(jìn)展〔J〕.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，50（5）：109-111.

*通信作者：張永云，講師.

（責(zé)任編輯 董 杰）

Effect of Allicin on the Proliferation of Human Lung Adenocarcinoma Cell SLC-89 ZHONG Yanling1,LI Weizhen2,ZHAO Sumei2,LIU Chunsheng3,ZHANG Yongyun2*

（1.Second People's Hospital of Yunnan Province,Kunming,650021,China; 2.Basic Experimental Research Center,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China; 3.Department of Oncological Surgery,First People's Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,China）

Objective:To investigate the effect of allicin on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line（SLC-89）. Methods:SLC-89 cells were cultured under different doses of allicin for 72 h,the 50%inhibitory concentration（IC50）was measured by MTT method.SLC-89 cells were then cultured with allicin at dose IC50,IC50/2,IC50/4 for 72 h,respectively,telomerase activities of the treated cells were measured by Telomeric Repeat Amplification Protocol with ELISA（TRAP-ELISA）,and expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）of the treated cells were tested by flow cytometry.Results:Allicin inhibited proliferation of SLC-89 with IC50of 79.8μg/mL.Allicin at dose of IC50and IC50/2 significantly inhibited telomerase activity of SLC-89 cells,and Allicin at dose of IC50,IC50/2 and IC50/4 significantly inhibited the expression of PCNA of SLC-89 cells.Conclusion:Allicin could inhibit proliferation of SLC-89 cells,compared to the telomerase activity,the expression of PCNA could be down-regulated more easily than by Allicin.

Allicin;telomerase activity;PCNA;SLC-89 cell;lung adenocarcinoma

R734.2

A

1672-2345（2012）06-0032-03

云南省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（2011Y440）

2012-03-13

2012-05-08

鐘燕玲，主治醫(yī)師，主要從事臨床腫瘤治療研究.