美洲大蠊提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖能力的影響

張小雪，李春艷，徐 靜，雷占平，段云忠，賴 泳

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖能力的影響

張小雪，李春艷，徐 靜，雷占平，段云忠，賴 泳*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）增殖的影響。方法：用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同濃度樣品在不同培養(yǎng)時(shí)間作用下HSC-T6細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，樣品Ⅰ抑制了HSC-T6的增殖，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用加強(qiáng)，在一定的濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性，培養(yǎng)72 h時(shí)作用最強(qiáng)。樣品Ⅱ與樣品Ⅰ作用效果相似，但抑制作用略小于樣品Ⅰ。樣品Ⅲ在作用24 h時(shí)，有一定抑制作用，而在其他時(shí)間段基本沒有抑制作用。結(jié)論：樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均能抑制HSC-T6的增殖，有可能成為防治肝纖維化的理想藥。

肝星狀細(xì)胞；美洲大蠊提取物；細(xì)胞增殖；抑制作用

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化甚至原發(fā)性肝細(xì)胞癌的必經(jīng)階段，是各種慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，研究表明如果不經(jīng)過合理的治療，其中約10%的患者5~10年后發(fā)展成為肝硬化，如果能阻滯或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)展，將顯著改善肝病患者的生存質(zhì)量和預(yù)后〔1〕。肝纖維化的機(jī)制主要是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過量產(chǎn)生和降解減少，導(dǎo)致ECM在肝臟沉積，形成纖維化。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是參與肝纖維化過程的最主要細(xì)胞成分〔2〕，其活化后大量增殖及生成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)。抑制HSC活化、增殖已成為抗肝纖維化的中心策略。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)大鼠HSC-T6細(xì)胞株為研究對(duì)象，設(shè)定不同濃度的美洲大蠊提取物進(jìn)行干預(yù)，觀察美洲大蠊提取物對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響，在細(xì)胞水平上探討美洲大蠊提取物抗肝纖維化的初步作用。

1 材料

1.1 藥物樣品Ⅰ、樣品Ⅱ、樣品Ⅲ由云南大理學(xué)院李樹楠教授提供；樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶于無血清的改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中，用0.22μm微孔濾器過濾，配成濃度為10 mg/mL的母液儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。用時(shí)用含有10%的DMEM稀釋，樣品Ⅰ、樣品Ⅱ、樣品Ⅲ終濃度分別為5 000、1 000、200、40、8、1.6、0.32、0.064μg/mL。

1.2 細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞株購(gòu)自上海弗雷堡生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 主要試劑DMEM（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)）；0.25%胰蛋白酶（Solarbio）；MTT（二甲基噻唑二苯基四唑嗅鹽）為Amresco公司生產(chǎn)。

1.4 主要儀器連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BIO-Tek公司）、Olympus IX-7型倒置相差顯微鏡、水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)thermo）、Yj-1450型無菌操作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、高Es-315型壓滅菌器（日本Tomykogyo公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞接種HSC-T6用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，將其稀釋成5×104/mL的濃度，接種于96孔板，每孔100μL，5%濃度的CO2條件，37℃培養(yǎng)24 h〔3〕。

2.2 美洲大蠊提取物對(duì)HSC-T6的影響實(shí)驗(yàn)在已培養(yǎng)24 h的HSC-T6細(xì)胞，分別加入8個(gè)濃度梯度的樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，使其最終濃度分別為5 000、1 000、200、40、8、1.6、0.32、0.064μg/mL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放入37℃，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清后每孔分別加入DMSO，待每孔紫色結(jié)晶溶解后，在波長(zhǎng)495 nm檢測(cè)各孔OD值〔4〕。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS（17.0）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以x±s表示。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)果處理樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)HSC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按下述公式計(jì)算：

抑制率%=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%。

3.2 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ24 h對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制作用與陰性對(duì)照組比較，培養(yǎng)24 h后，樣品Ⅰ在濃度為5 000和1 000μg/mL時(shí)對(duì)HSC-T6的增殖有明顯抑制作用（P＜0.01），在濃度為200μg/mL時(shí)對(duì)HSC-T6的增殖有一定抑制作用（P＜0.05）；樣品Ⅱ在濃度為5 000和1 000μg/mL時(shí)對(duì)HSC-T6的增殖有明顯抑制作用（P＜0.01），在濃度為200和40μg/mL有一定抑制作用（P＜0.05）；樣品Ⅲ在濃度為5 000μg/ mL時(shí)有一定抑制作用（P＜0.05），其余濃度組無明顯抑制作用（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用24 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用（

表1 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用24 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用（

注：陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

劑量/（μg/mL） 抑制率（x±s）樣品Ⅰ 樣品Ⅱ 樣品Ⅲ5 000.000 69.16±12.24** 79.17±14.77** 38.55±7.57*1 000.000 52.20±24.45** 68.64±24.44** 12.64±18.05 200.000 44.98±8.87* 51.19±24.50* -7.91±2.35 40.000 36.09±9.02 48.37±22.81* -18.07±4.34 8.000 31.00±10.11 36.41±4.52 -17.76±6.02 1.600 34.51±7.79 39.95±9.85 -19.05±7.71 0.320 30.77±6.63 37.06±7.34 -22.66±6.78 0.064 25.65±8.05 28.61±3.20 -22.00±7.58

圖1 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用24 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制率

3.3 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在對(duì)HSC細(xì)胞作用48 h的增殖影響與陰性對(duì)照組相比較，樣品Ⅰ在濃度為5 000、1 000、200、40、8μg/mL時(shí)對(duì)HSC的增殖有明顯抑制作用（P＜0.01），且在濃度為1.6及0.032μg/mL對(duì)HSC-T6增殖有一定抑制作用（P＜0.05）；樣品Ⅱ在濃度為5 000、1 000、200、40及8μg/mL時(shí)對(duì)HSC-T6增殖有明顯抑制作用（P＜0.01），且在濃度1.6μg/mL時(shí)有一定抑制作用；樣品Ⅲ的作用不明顯（P＞0.05）。見表2、圖2。

表2 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用48 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用

表2 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用48 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用

注：陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

劑量/（μg/mL） 抑制率（x ±s）樣品Ⅰ 樣品Ⅱ 樣品Ⅲ5 000.000 53.20±5.32** 61.14±10.27** 21.74±4.83 1 000.000 43.77±5.03** 52.90±13.83** 7.12±3.25 200.000 43.48±6.61** 41.97±8.64** 4.16±2.97 40.000 40.50±11.72** 41.38±10.09** 2.44±0.58 8.000 37.84±10.25** 39.33±9.70** -0.30±0.17 1.600 32.71±13.63* 33.12±15.82* -6.98±3.24 0.320 32.04±10.11* 30.28±15.02 -4.24±1.17 0.064 -58.96±12.32 0.41±0.15 -4.14±5.32

圖2 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用48 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制率

3.4 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制率與陰性對(duì)照組比較，樣品Ⅰ在濃度為5 000、1 000、200、40、8、1.6及0.32μg/mL時(shí)對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制有明顯作用（P＜0.01）；樣品Ⅱ在濃度為5 000、1 000、200、40、8、1.6及0.32μg/mL時(shí)對(duì)HSC細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.01）；樣品Ⅲ無明顯抑制作用。見表3、圖3。

4 討論

病毒感染、長(zhǎng)期飲酒等均可導(dǎo)致慢性肝損傷而發(fā)展成肝纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化及原發(fā)性肝細(xì)胞癌。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)途徑〔3〕，根據(jù)疾病發(fā)展的不同階段，采取抗肝纖維化治療為一種有效手段。關(guān)于抗肝纖維化的研究近年來有不少報(bào)道，但目前臨床治療肝纖維化的西藥中療效確切、不良反應(yīng)少的藥物較少且大多還處在實(shí)驗(yàn)研究階段。中藥在抗肝纖維化治療中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，且主要來源于植物或動(dòng)物。而昆蟲作為一類新的醫(yī)藥資源寶庫，其藥用價(jià)值值得深入研究。

表3 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用

表3 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用

注：陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

劑量/（μg/mL） 抑制率（x ±s）樣品Ⅰ 樣品Ⅱ 樣品Ⅲ5 000.000 67.70±2.94** 64.42±17.10** -26.90±5.67 1 000.000 61.15±6.21** 69.00±10.88** -17.41±4.38 200.000 67.05±4.66** 65.35±4.68** -23.08±7.74 40.000 68.54±3.36** 63.63±8.05** -36.59±8.64 8.000 65.76±4.71** 69.64±3.08** -7.56±2.56 1.600 66.94±4.17** 59.72±14.55** -8.04±5.12 0.320 61.98±4.23** 59.58±7.85** -6.97±3.45 0.064 -83.35±12.34* 4.96±1.61 -15.66±6.12

圖3 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制率

蜚蠊科大蠊屬昆蟲美洲大蠊具有抗肝炎、抗腫瘤、抗菌、抗艾滋病病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、消炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)血管增生、組織修復(fù)等作用〔5-8〕。文獻(xiàn)報(bào)告美洲大蠊提取物具有抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用，但作用機(jī)制尚不明確〔9〕。在肝纖維化形成的過程中，肝星狀細(xì)胞的“持久化”激活和增殖是中心環(huán)節(jié)，阻抑激活的HSC增殖和誘導(dǎo)促進(jìn)HSC凋亡是防治肝纖維化的重要措施。因此，肝星狀細(xì)胞的激活及增殖最終是導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平，觀察樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：美洲大蠊提取物可以抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，且樣品Ⅰ、Ⅱ在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，樣品Ⅲ對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用弱于樣品Ⅰ、Ⅱ。

綜上所述，美洲大蠊提取物能抑制體外肝星狀細(xì)胞的增殖，起到抗肝纖維化作用，為美洲大蠊的臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。

〔1〕馬雄，魏玨.非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝纖維化的研究現(xiàn)狀〔J〕.內(nèi)科理論與實(shí)踐，2008，3（1）：18-22.

〔2〕Henderson NC,Iredale JP.Liverfibrosis:cellularmechanisms of progression and resolution〔J〕.Clin Sci（Lond），2007，112（5）：265-280.

〔3〕王怡，薛紹禮，張菁，等.三七總皂甙對(duì)傳代肝星狀細(xì)胞增殖的影響〔J〕.淮海醫(yī)藥，2008，26（1）：1-3.

〔4〕朱曉云，祁鑫，王兆禮，等.化痰散結(jié)中藥對(duì)甲狀腺細(xì)胞增殖與凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（140）：31-34.

〔5〕胡艷芬，呂小滿，劉光明，等.美洲大蠊提取物對(duì)3株人肺癌細(xì)胞的體外抑制作用〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，12（8）：1-3.

〔6〕何正春，胡明輝，王曉雨，等.美洲大蠊提取物對(duì)3株人及小鼠白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30（5）：56-57.

〔7〕焦春香，劉光明，周萍.天然藥物康復(fù)新的研究進(jìn)展〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（11）：2623-2624.

〔8〕戴云，曾茗，項(xiàng)朋志.蜚蠊的藥用價(jià)值〔J〕.中藥材，2005，28（9）：848-850.

〔9〕李武，段麗芳，何貴清，等.美洲大蠊提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（5）：1137-1138.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

Cell Proliferation Effect of Periplaneta americana Extracts on Hepatic Stellate Cells

ZHANG Xiaoxue,LI Chunyan,XU Jing,LEI Zhanping,DUAN Yunzhong,LAI Yong*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the proliferation effects of Periplaneta americana extracts（samplesⅠ,Ⅱ,Ⅲ）on rat hepatic stellate cell lines（HSC-T6）in vitro.Methods:HSC-T6 proliferation under the treatment of Periplaneta americana extracts in different concentration and time was determined by MTT method.Results:Compared with the control group,HSC-T6 proliferation was inhibited by sampleⅠ with time dependence and reached the peak at 72 hours with concentration dependence within a certain range.SampleⅡ showed the same inhibitory pattern but with less effect.SampleⅢ showed a particular inhibition effect in 24 hours,and no effect at other time points.Conclusion:The samplesⅠ,Ⅱ,Ⅲ can inhibit hepatic stellate cell proliferation,which may be a potential drug for prevention and treatment of liver fibrosis.

hepatic stellate cells;Periplaneta americana extracts;cell proliferation;inhibition

R285.5

A

1672-2345（2012）06-0016-04

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金項(xiàng)目（DXSKYX201020）

2012-01-04

2012-03-08

張小雪，藥學(xué)專業(yè)2009級(jí)本科生. *通信作者：賴泳，副教授.