HPLC同時(shí)測(cè)定明目上清片中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量

周 萍，周 濃，張海珠

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

HPLC同時(shí)測(cè)定明目上清片中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量

周 萍，周 濃，張海珠

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定明目上清片中鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的高效液相色譜方法。方法：Agilent Zorbax Exlipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫為25℃；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（45∶55）；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。結(jié)果：鹽酸小檗堿在1.02~20.40μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9）；黃芩苷在4.54~90.80μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8）；鹽酸小檗堿、黃芩苷平均加樣回收率為99.2%，101.2%，RSD分別為1.1%和1.6%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于本制劑的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；明目上清片；鹽酸小檗堿；黃芩苷

明目上清片是由黃芩、黃連、當(dāng)歸、陳皮、梔子、連翹、菊花、蒺藜等21味中藥材經(jīng)加工制成，具有清熱散風(fēng)、明目止痛的功效，用于暴發(fā)火眼?，F(xiàn)收錄于《中國(guó)藥典》2010年版第一部〔1〕，測(cè)定黃連中的鹽酸小檗堿作為含量控制指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定明目上清片中黃芩苷的含量〔2〕及橙皮苷的含量〔3〕，但復(fù)方中藥制劑只測(cè)量一種指標(biāo)成分并不能有效地控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。中藥制劑中同時(shí)測(cè)定鹽酸小檗堿和黃芩苷兩種成分含量已有報(bào)道〔4-8〕，由于不同制劑所含藥材及輔料不同，產(chǎn)生的干擾不同。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定明目上清片中黃連、黃芩中的鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的高效液相色譜法（HPLC）。結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，減少了檢驗(yàn)成本，降低工作量，為該藥的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters 600E高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；AS20500BDT超聲波清洗器（天津奧特塞思斯儀器有限公司）；FA2004N電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超純水儀（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑鹽酸小檗堿、黃芩苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為：110713-200805，110715-200514）。明目上清片為市售品（批號(hào)：090301，090501，20090901）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax Exlipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（45∶55）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿和黃芩苷對(duì)照品適量分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得各自的對(duì)照品溶液，精密量取各對(duì)照品溶液適量置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸小檗堿0.204 mg·mL-1和黃芩苷0.908 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取明目上清片20片，去包衣，研細(xì)，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇（1∶100）混合溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，臨用前以0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例，分別稱取除黃連、黃芩以外的其余藥味，依照明目上清片的制備工藝制成相應(yīng)的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下操作，制成鹽酸小檗堿、黃芩苷陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。兩組分色譜峰與相鄰其他色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算大于6 000，按黃芩苷計(jì)算大于4 000，陰性對(duì)照對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品及陰性對(duì)照色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸小檗堿和黃芩苷的HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察依次精密吸取混合對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL量瓶中，用稀鹽酸-甲醇（1∶1）稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10μL分析，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度在1.02~20.40μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=30 364X+ 27 054，r=0.999 9。黃芩苷的質(zhì)量濃度在4.54~90.80 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y= 36 538X+54 862，r=0.999 8。

2.5 儀器精密度試驗(yàn)取同一混合對(duì)照品溶液在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，鹽酸小檗堿和黃芩苷峰面積的RSD分別為0.69%和1.2%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品（批號(hào)：090301），按“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，鹽酸小檗堿和黃芩苷含量平均值分別為2.157 mg·g-1，8.102 mg·g-1，RSD分別為0.98%、1.1%。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.2%和1.4%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)分別稱取已知含量的樣品（批號(hào)：090301）0.2 g，共9份，按低、中、高質(zhì)量濃度分別加入鹽酸小檗堿、黃芩苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定取“1.2”項(xiàng)下不同廠家生產(chǎn)的樣品，每批取3份，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各組分含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)提取溶劑的考察方法為，分別選取甲醇、70%甲醇、70%乙醇、鹽酸-甲醇（1∶100）為溶劑，對(duì)同一樣品超聲提取30 min，比較待測(cè)化合物的峰面積，結(jié)果表明提取溶劑為甲醇和乙醇時(shí)，所得鹽酸小檗堿峰面積明顯小于以鹽酸-甲醇作提取溶劑的峰面積，而黃芩苷色譜峰峰面積的差別不大。本實(shí)驗(yàn)考察了超聲20、30、40 min3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)超聲30 min，2種指標(biāo)成分能夠提取完全。因此，本實(shí)驗(yàn)樣品的制備條件以鹽酸-甲醇（1∶100）為提取溶劑，超聲30 min。

表3 鹽酸小檗堿、黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

紫外掃描顯示鹽酸小檗堿最大吸收波長(zhǎng)為223、265、345 nm處，黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)為276、324 nm。由于黃芩苷含量高于鹽酸小檗堿，本實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸小檗堿的最大吸收波長(zhǎng)265 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷峰面積在265 nm和276 nm檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差別。在265 nm波長(zhǎng)下能同時(shí)檢測(cè)鹽酸小檗堿和黃芩苷，并保證兩成份有適宜的靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別選用乙腈-0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀（3∶7）、乙睛-甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-三乙胺（25∶7∶76∶0.23，以磷酸調(diào)pH3.1）、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（34∶60∶6∶0.2）、甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-水（含0.05%磷酸和0.1%三乙胺）、甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀-冰醋酸（40∶60∶1）〔8〕等作為流動(dòng)相，分別采用各文獻(xiàn)中等度或梯度兩種洗脫方式，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿與干擾成分分離效果不理想或兩目標(biāo)成份出峰時(shí)間太長(zhǎng)。經(jīng)摸索，最終選擇流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸（45∶55）時(shí)，鹽酸小檗堿和黃芩苷在20 min內(nèi)出峰，其他成分不干擾，分離度好，且節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部〔S〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：814.

〔2〕袁汀，郝延軍.高效液相色譜法測(cè)定明目上清片中黃芩苷含量〔J〕.山西醫(yī)藥雜志，2009，38（10）：963-964.

〔3〕柴金苗.高效液相色譜法測(cè)定明目上清片中橙皮苷的含量〔J〕.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（12）：43-44.

〔4〕胡春麗，王冬梅，張鵬，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸龍薈片中黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量〔J〕.藥物分析雜志，2008，28（12）：2011-2014.

〔5〕梁盈軍，舒潔倩.HPLC法測(cè)定黃連解毒湯傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒中鹽酸小檗堿和黃芩苷含量的研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5（4）：14-15.

〔6〕胡茂華，鐘玲，黃小玉，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定藍(lán)芩口服液中鹽酸小檗堿與黃芩苷的含量〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（2）：210-211.

〔7〕張婷，周平蘭.HPLC法測(cè)定復(fù)方芩柏顆粒中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2009，20（4）：349-351.

〔8〕馬群，艾路，劉勇，等.安宮牛黃丸中梔子苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量測(cè)定研究〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2009，34（20）：2647-2648.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

Simultaneous Determination of Berberine Hydrochloride and Baicalin in Mingmushangqing Tablets by HPLC

ZHOU Ping,ZHOU Nong,ZHANG Haizhu
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determination of berberine hydrochloride and baicalin in Mingmushangqing tablets.Methods:HPLC was carried out with indexes of Agilent Zorbax Exlipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）,column temperature at 25°C,the mobile phase of methanol-0.2%phosphoric acid（55∶45）,flow rate at 1.0 mL·min-1,and detection wavelength at 265 nm.Results：The method showed good linear relationships within the range of 1.02-20.40μg·mL-1（r=0.999 9）for berberine hydrochloride and 4.54-90.80μg·mL-1（r=0.999 8）for baicalin, respectively.The average recoveries were 99.2%（Relative Standard Deviation RSD=1.1%）and 101.2%（RSD=1.6%）.Conclusion: The method described above is simple,accurate and reproducible which could be used for the quality control of Mingmushangqing tablets.

HPLC;Mingmushangqing tablets;berberine hydrochloride;baicalin

R917

A

1672-2345（2012）06-0012-04

2011-11-18

2012-03-27

周萍，教授，主要從事藥物質(zhì)量控制研究.