應(yīng)用重組改良型人膜聯(lián)蛋白檢測動脈粥樣硬化斑塊的實(shí)驗(yàn)研究

宋麗萍 ，華子春 ，張 欣 ，邢海燕 ，軒 楠

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000；2.南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093）

動脈粥樣硬化（AS）的臨床表現(xiàn)和預(yù)后主要取決于斑塊類型而不是其大小。急性冠狀動脈綜合征（不穩(wěn)定心絞痛、心肌梗死和心源性猝死）是導(dǎo)致冠心病患者死亡的主要因素，而不穩(wěn)定斑塊破裂、血栓形成則是導(dǎo)致急性冠狀動脈綜合征的關(guān)鍵機(jī)制。因此，在體外確定不穩(wěn)定斑塊，以求早期采取必要的措施控制AS的進(jìn)一步發(fā)展具有重要的應(yīng)用價值。

近年來國內(nèi)外一些學(xué)者根據(jù)AS不穩(wěn)定斑塊形成過程中存在大量的凋亡細(xì)胞，進(jìn)行了凋亡顯像的研究。在AS斑塊組織中，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞都存在著死亡過程，而死亡細(xì)胞的發(fā)生都是通過凋亡進(jìn)行的。細(xì)胞凋亡在AS的病理生理過程中起重要作用。膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）是人體內(nèi)源性蛋白質(zhì)，可與凋亡早期細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合（Phosphatidyserine，PS）[1]。 因此，用99mTc標(biāo)記Annexin V可進(jìn)行AS斑塊的細(xì)胞凋亡顯像的研究。由南京大學(xué)新藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室對Annexin V進(jìn)行重組研究的基礎(chǔ)上，將Annexin V的N端接入一段10個組氨酸（Histidine）結(jié)構(gòu)的多肽，從而構(gòu)建內(nèi)源性锝鰲合位點(diǎn)[2]，在不改變Annexin V生物活性基礎(chǔ)上，提高其與99mTc的結(jié)合效率及穩(wěn)定性。本研究通過99mTc直接標(biāo)記 H-Annexin V，探討99mTc-H-Annexin V對兔AS模型顯像的價值。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物：健康雄性大耳白兔7只，體重2.5～3.5kg，均由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

試劑H-Annexin V由南京大學(xué)新藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。99mTcO4-由北京原子高科核技術(shù)有限公司提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器SPECT為GE公司生產(chǎn)的infiniaⅡ雙探頭可變角度帶符合線路的SPECT。GC-911型γ計(jì)數(shù)器為合肥中佳光電儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 兔AS模型的制備

7只雄性大耳白兔，體重2.5～3.5kg。隨機(jī)分為模型組和正常對照組，模型組4只（其中1只用于模型對照研究），正常對照組3只。模型組給予高脂飲食 （內(nèi)含2%的膽固醇和5%豬油），正常對照組給予正常飼料。飼養(yǎng)2周后模型組行降主動脈球囊拉傷。10%水合氯醛（3ml/kg體重）靜脈注射麻醉動物，腹股溝區(qū)觸摸股動脈搏動，縱向切開皮膚，分離皮下組織，鈍性分離股動脈、靜脈和神經(jīng)。切開股動脈，球囊導(dǎo)管插入股動脈，上行插入約30cm后，給球囊注入生理鹽水0.2ml，向下拖拉球囊至髂總動脈分叉處，反復(fù)3次?？p合動脈切口和皮膚，青霉素80萬單位腹腔注射3d，防止感染。術(shù)后繼續(xù)給予含2%膽固醇和5%豬油的高脂飼料，15周后進(jìn)行主動脈在體和離體顯像。

1.2.299mTc-H-Annexin V的制備

取凍干品H-Annexin V 500μg以生理鹽水溶解，加入緩沖液 （50mm PBS，140mm NaCl，5%甘油，pH 值為 7.6），再加入約40μg還原劑SnCl2，然后在其中加入37～55.5MBq/kg99mTc進(jìn)行直接標(biāo)記，混勻，條件均為常溫下震蕩，37°孵化25min，取出自然冷卻到室溫。

1.2.399mTc-H-Annexin V的標(biāo)記率的測定

采用紙層析法測定標(biāo)記率，取標(biāo)記混合物用新華1號層析紙，丙酮作展開劑，點(diǎn)樣后上行展開一段距離，取出晾干，然后從原點(diǎn)下0.5cm開始，每間隔1cm將層析紙分段剪裁，用γ計(jì)數(shù)器測定各段放射性計(jì)數(shù)。

1.2.499mTc-H-Annexin V活體兔AS斑塊顯像

取15周的兔進(jìn)行顯像。以10%水合氯醛（3ml/kg體重）麻醉兔后固定，自耳緣靜脈注射99mTc-H-Annexin V 37～55.5MBq/kg。注射后10、30min和1、2h行靜態(tài)平面前后位及后前位顯像。顯像儀器為美國GE公司生產(chǎn)的infiniaⅡ雙探頭可變角度帶符合線路的SPECT儀，配低能高分辨型準(zhǔn)直器，能峰140keV，窗寬20%。矩陣128×128，放大倍數(shù)2.0。視野包括腹主動脈、部分肝脾、雙腎和膀胱。并計(jì)算2h兩組動物降主動脈靶/非靶（T/NT）比值。

1.2.5 兔AS斑塊離體血管顯像及血管片段放射性測定

活體顯像后，注射過量的10%水合氯醛處死動物，進(jìn)行解剖。小心暴露動物心臟至髂總動脈分叉之間的胸腹主動脈，清除附著于動脈上的脂肪與組織，取出降主動脈。沿腹側(cè)縱向剪開動脈壁，以生理鹽水沖洗干凈后的離體血管按斑塊的分布剪成若干等份，每段血管用電子天平稱質(zhì)量并用γ計(jì)數(shù)器測定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每毫克組織放射性強(qiáng)度（cpm/mg）。

1.2.6 病理結(jié)果

將離體血管標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，T/NT的比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS兔模型的制備

經(jīng)球囊損傷血管內(nèi)皮及高脂飲食后，15周AS兔模型制備完成。光學(xué)顯微鏡下可見薄的纖維帽形成，大的脂質(zhì)壞死中心，細(xì)胞外基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞很少，內(nèi)膜可見有少量的泡沫細(xì)胞（圖1），正常免腹主動脈內(nèi)皮HE染色見圖2。

2.2 99mTc-H-Annexin V的標(biāo)記結(jié)果

標(biāo)記率為95.23%～96.15%，平均為95.82%±0.28%。

2.3 兔AS活體核素成像結(jié)果

模型組兔腹主動脈在注射99mTc-H-Annexin V后10min可見沿主動脈走行的放射性條狀影，隨著時間延長，放射性攝取呈不均勻性增加，2h顯影較為清晰。而對照組兔在注射后10min見主動脈顯影，但隨著時間的延長，放射性逐漸消退，2h主動脈顯影不清晰。模型組注射99mTc-H-Annexin V后 2h T/NT 比值為 2.68±0.25，明顯高于對照組（1.57±0.24，t=5.44，P＜0.01）。 1 只模型對照組兔注射99mTcO4-后 10min 至2h，腹主動脈顯影均不清晰（圖3～8）。

2.4 離體血管顯影結(jié)果

注射99mTc-H-Annexin V后2h處死模型組兔，分離出降主動脈，肉眼可見降主動脈內(nèi)膜面大小不等的淡黃色斑塊樣突起。離體主動脈顯像可見對應(yīng)部位放射性濃聚。含AS斑塊血管片段的放射性攝取為（63.33±14.11）cpm/mg，明顯高于非斑塊的血管片段（21.75±8.30）cpm/mg（t=9.53，P＜0.01）（圖 9）。

圖1 兔腹主動脈AS HE染色切片圖，可見大的脂質(zhì)壞死中心，并有薄的纖維帽。 圖2 正常兔腹主動脈內(nèi)皮HE染色切片圖。Figure 1. Rabbitabdominalaorta atherosclerosis HE stain showed:large lipid necrotic center and thin fiberous cap.Figure 2. Normal rabbit abdominal aorta HE stain.

圖3 實(shí)驗(yàn)組30min：可見降主動脈清晰顯影。 圖4 實(shí)驗(yàn)組2h：可見降主動脈仍清晰顯影。 圖5 正常對照組30min，可見降主動脈顯影不清晰。 圖6 正常對照組2h，可見降主動脈顯影不清晰。Figure 3. The image showed that the descending aorta was clear in experiment group at 30 minutes. Figure 4. The image showed that the descending aorta was clear in experiment group at 2 hours. Figure 5. The image showed that descending aorta was not clear in control group at 30 minutes.Figure 6.The image showed that the descending aorta was not clear in control group at 2 hours.

圖7 兔降主動脈AS模型99mTcO4-顯像結(jié)果：30min時主動脈影像不清晰。 圖8 兔降主動脈AS模型99mTcO4-顯像結(jié)果：2h主動脈影像仍不清晰。 圖9 AS兔降主動脈離體標(biāo)本顯像，可見降主動脈清晰顯影。Figure 7. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis99mTcO4-imaging showed:the descending aorta image was not clear at 30 minutes. Figure 8. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis99mTcO4-imaging showed:the descending aorta image was not clear at 2 hours. Figure 9. The rabbit abdominal aorta atherosclerosis in vitro imaging:descending aorta image was clear.

3 討論

近年來國內(nèi)外許多學(xué)者已根據(jù)AS形成過程中某些相關(guān)分子和細(xì)胞，進(jìn)行了放射性核素顯像的研究。也有一些學(xué)者根據(jù)AS不穩(wěn)定斑塊形成過程中存在大量的凋亡細(xì)胞，進(jìn)行了凋亡顯像的研究。

在AS斑塊組織中，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞都存在著死亡過程，而死亡細(xì)胞的發(fā)生都是通過凋亡進(jìn)行的。Annexin V是人體內(nèi)源性蛋白質(zhì)，含有319個氨基酸，分子質(zhì)量為35.8×103，折疊成平面環(huán)行結(jié)構(gòu)，稱之為內(nèi)聯(lián)蛋白重疊[3]，可與凋亡早期細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合。由此，放射性標(biāo)記的Annexin V最早被研制成細(xì)胞凋亡顯像劑，用于活體監(jiān)測及定量測定細(xì)胞凋亡。Johnson等[1]報(bào)道，99mTc-Annexin V在豬AS模型中顯示冠狀動脈的斑塊，免疫組化結(jié)果提示，平滑肌細(xì)胞凋亡顯像顯示的病變動脈段的細(xì)胞凋亡率明顯高于周圍正常動脈段及對照組的動脈段。同時，Buck等[4]體外放射性核素顯像表明，99mTc-Annexin V的攝取量與主動脈AS部位血管損傷的嚴(yán)重程度、巨噬細(xì)胞凋亡的數(shù)量成正相關(guān)。

由于細(xì)胞凋亡與AS斑塊的不穩(wěn)定密切相關(guān)，因此用放射性核素標(biāo)記的Annexin V進(jìn)行AS斑塊的無創(chuàng)傷性檢測是可行的。

有研究報(bào)道：多種核素曾被用于標(biāo)記Annexin V，包括99mTc、123I、124I、125I、18F 等， 而99mTc 制備容易、 價格低廉， 適合SPECT顯像[5-6]。然而，直接用99mTc標(biāo)記的Annexin V將產(chǎn)生一些變性蛋白，且標(biāo)記率較低。以HYNIC結(jié)合放射性核素的方式標(biāo)記率高，但標(biāo)記過程較直接標(biāo)記法復(fù)雜，腎臟的攝取高。H-Annexin V是在Annexin V的生物結(jié)構(gòu)中尋找活性區(qū)域并進(jìn)行克隆得到的保持甚至于超過Annexin V生物活性的一種多肽，既保持了Annexin V對于PS的強(qiáng)親和力，又引進(jìn)了更多的結(jié)合位點(diǎn)，提高了其與99mTc的結(jié)合效率及穩(wěn)定性，而且標(biāo)記方法更加簡單，穩(wěn)定性好[2]。

本研究應(yīng)用99mTc-H-Annexin V進(jìn)行兔AS活體顯像，可見AS血管對99mTc-H-Annexin V的攝取明顯高于正常血管，顯像結(jié)果良好。AS血管標(biāo)本的離體顯像及其片段的放射性攝取測定也表明AS病灶與Annexin V的大量結(jié)合。因此，99mTc-H-Annexin V可用于無創(chuàng)檢測AS斑塊。

本研究的局限性：本實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量較少，而模型對照組只有1只實(shí)驗(yàn)動物，所以沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，還需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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