生姜莖基腐病病原拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

韓超　武貴元　劉愛新　徐坤

摘 要： 從生姜根際土壤分離得到62個細(xì)菌分離物。以姜莖基腐病病原菌（Pythium myriotylum）為指示菌，共選出7株對姜莖基腐病菌有良好拮抗效果的細(xì)菌菌株。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定，16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等，X-11、JK-14、SF-19、SF-23等4株初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus spp），JK-19、JK-28、JK-25 3株鑒定為類芽孢桿菌屬（Peanibacillus spp）。SF-19、SF-23、JK-25、JK-19、JK-28、X-11和JK-14的16S rDNA序列的GenBank登錄號分別為JQ283970、JQ283971、JQ283972、JQ283973、JQ283974、JQ283975、JQ283976和JQ283977。進(jìn)一步分析表明，7株拮抗菌對Rhizoctonia solani、Fusarium graminearum、Verticillium dahliae等多種類型的病原真菌有較好的抑制作用；顯微觀察結(jié)果表明，拮抗菌可導(dǎo)致病菌菌絲細(xì)胞頂端膨大、菌絲體畸形、分隔增多等變化。

關(guān)鍵詞：生姜莖基腐?。籔ythium myriotylum；根際；拮抗細(xì)菌；鑒定

中圖分類號：S476+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2012）11-0084-06

Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against

Ginger Rhizome Rot Pathogen Pythium myriotylum

Han Chao1， Wu GuiYuan1， Liu AiXin1*， Xu Kun2*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018，China；

2. College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University， Taian 271018，China）

Abstract Sixty-two bacteria were isolated from the ginger rhizosphere soil and seven showed better antagonistic effects to Pythium myriotylum. According to the results of morphologic characteristics， physiological and biochemical properties and phylogenetic analysis of bacteria 16S rDNA， the strains of X-11， JK-14， SF-19 and SF-23 were preliminary identified as Bacillus spp.， and the strains of JK-19， JK-28 and JK-25 belonged to Peanibacillus spp.. The sequences of 16S rDNA of the 7 strains had been submitted to GenBank， and their accession numbers were as follows：SF-19 as JQ283971， SF-23 as JQ283972， JK-25 as JQ283973， JK-19 as JQ283974， JK-28 as JQ283975， X-11 as JQ283976， JK-14 as JQ283977， respectively. All the 7 strains also showed inhibition to Rhizoctonia solani， Fusarium graminearum， Verticillium dahliae and so on. The microscopic examination showed that the antagonistic bacteria could make the hypae cell tip swollen， the mycelia deformed and the compartment increased.

Key words Ginger rhizome rot； Pythium myriotylum； Rhizosphere； Antagonistic bacteria； Identification

生姜莖基腐病又稱生姜軟腐病、生姜莖腐病等，是目前生姜生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害。該病最早報道于印度，現(xiàn)已遍布日本、韓國、斐濟、澳大利亞、中國及臺灣等多個國家和地區(qū)[1，2]。姜莖基腐病主要危害植株莖基部及姜塊，表現(xiàn)為地上部植株枯黃，地下莖及姜塊腐爛，一般地塊可損失8%～30%，重病地塊可減產(chǎn)50%～90%，甚至絕產(chǎn)[2]。有研究表明，引起生姜莖基腐病的病原為群結(jié)腐霉（Pythium myriotylum）。該病菌主要通過病田土壤傳播，同時帶菌姜塊在儲存及移栽時也可進(jìn)一步加重該病的發(fā)生和危害。目前國內(nèi)外對該病害多采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治[3，4]，由于該病原菌主要存在于土壤，因此藥劑防治不但會出現(xiàn)因用藥量大而帶來的環(huán)境污染問題，而且很難從根本上治理該病害。利用根際有益微生物防治該類病害具有獨特的優(yōu)勢，并在土傳病害防治研究中開展了很多有益嘗試[5，6]。本研究從發(fā)生姜莖基腐病的土壤中分離、鑒定到7株對莖基腐病菌有良好拮抗效果的細(xì)菌，并對其抑菌效果和抑菌機理進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步開展生姜莖基腐病的生物防治提供了依據(jù)。

1 材料與方法

11 試驗材料

于2011年8～9月份生姜莖基腐病發(fā)病盛期，從山東泰安、萊蕪等生姜種植區(qū)的發(fā)病地塊采集土壤樣品，用于拮抗細(xì)菌的分離。

以生姜莖基腐病菌（Pythium myriotylum）為指示菌篩選拮抗菌，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、甜瓜黑斑病菌（Alternaria alternata）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）和黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）等用于抑菌譜測定，所用供試真菌均由本實驗室保存。

12 培養(yǎng)基

拮抗細(xì)菌分離、純化和培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基，病原真菌培養(yǎng)及拮抗菌篩選用PDA培養(yǎng)基，具體配制參照《微生物學(xué)實驗技術(shù)》[7]。

13 生姜根際細(xì)菌的分離與篩選

131 拮抗菌分離 稱取6 g土樣放入50 ml三角瓶中，加入30 ml無菌水，振蕩40 min，使之充分混勻。取1 ml上述懸浮液，加入10 ml離心管中，再加入9 ml無菌水，制備成10-1的懸浮液，同樣方法制備10-2、10-3濃度的懸浮液。用移液槍吸取50 μl稀釋倍數(shù)為10-3的溶液，加入NA固體培養(yǎng)基平板上，均勻涂布，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別用滅菌牙簽轉(zhuǎn)接到NA固體培養(yǎng)基平板，將純化的細(xì)菌28℃培養(yǎng)24 h后，存于30%甘油中，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

132 拮抗細(xì)菌的篩選 取處于對數(shù)生長期（OD600=05）的純化好的細(xì)菌分離物15 μl， 滴于PDA培養(yǎng)基平板的中心位置，于28℃恒溫培養(yǎng)2 d后，將指示菌Pythium myriotylum接種于PDA培養(yǎng)基上，距病原菌菌落約3 cm，28℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d，檢測抑菌效果。根據(jù)抑菌圈大小、指示菌及待測分離物菌落擴展速度、菌落邊緣是否出現(xiàn)稀疏和萎縮現(xiàn)象等判斷拮抗作用。對抑菌圈半徑大于15 cm的菌株，認(rèn)為對指示菌的生長與繁殖具有明顯抑制作用[8]。試驗重復(fù)3次，將具有穩(wěn)定拮抗效果的分離物保存于30%甘油中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

14 拮抗菌株的抑菌活性測定

對篩選出的拮抗菌進(jìn)行抑菌活性測定，以R solani、F graminearum、A alternata、V dahliae、P parasitica、C orbiculare等6種真菌作為供試菌，采用132所述方法進(jìn)行抑菌活性測定，每處理重復(fù)3次。

15 拮抗菌鑒定

151 形態(tài)觀察與生理生化鑒定 對拮抗效果較好的細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌落后，對其菌落特征進(jìn)行觀察并記錄[9]。

對菌體生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定[10，11]，包括過氧化氫酶（接觸酶） 、明膠液化、淀粉水解、V-P試驗及產(chǎn)H2S試驗等。

152 DNA提取和16S rDNA基因擴增及序列分析 菌株在LB培養(yǎng)基28℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，7 200 r/min離心，收集菌體。提取細(xì)菌基因組DNA[12，13]，用細(xì)菌16S rDNA通用引物（27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR擴增[14]。

PCR反應(yīng)體系（ 25 μl）為Taq酶（ 5 U/μl） 05 μl，10×Buffer（Mg2+） 25 μl，dNTPs（各25 mmol/L） 2 μl，引物各1 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 172 μl。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒回收目的片段，送上海桑尼生物科技有限公司測序。

將所測16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對，采用DNAMAN v522程序進(jìn)行多序列同源性分析。使用MEGA50軟件構(gòu)建phylogeny中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree，進(jìn)化距離采用Jukes-Cantor Model計算，系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法（Bootstrap）1 000次重復(fù)檢測[15]。

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 130（包括ANOVA方差分析）完成。

16 抑菌機制初步分析

參照132的方法對抑菌作用較好的菌株JK-14的抑菌機制進(jìn)行分析，用牙簽挑取對峙培養(yǎng)2 d的姜莖基腐病菌和立枯絲核菌的菌落邊緣，取少許菌絲制片，顯微鏡下觀察待測真菌菌絲形態(tài)的變化。2 結(jié)果與分析

21 拮抗細(xì)菌的篩選及拮抗效果

利用平板稀釋法從土壤樣品中分離到62個細(xì)菌分離物，以姜莖基腐病菌為指示菌，篩選出7個具有良好拮抗作用的菌株，分別是X-11、JK-14、SF-19、SF-23、JK-19、JK-28、JK-25， 7個菌株中以JK-14對P myriotylum抑菌作用最好，抑菌半徑為219 mm（表1）。部分菌株對P myriotylum的抑菌效果如圖1。

JK-14 JK-19 JK-28

圖1 部分細(xì)菌菌株對姜莖基腐病菌的抑菌效果

22 拮抗菌菌株對7種病原真菌的抑制作用

對7株拮抗作用明顯的細(xì)菌與其它真菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，測定抑菌效果。結(jié)果表明，7株拮抗菌對R solani、V dahliae、A alternata等6種植物病原真菌也表現(xiàn)較好的抑菌活性（表1）。由表1可見，JK-14對P myriotylum、V dahliae和A alternata都表現(xiàn)較好的抑菌作用，與其它菌株相比差異明顯。 JK-19對R solani抑菌效果最好，抑菌半徑約25 mm，X-11對F graminearum、V dahliae和P parasitica等3種真菌的抑菌作用都明顯好于其它菌株。

表1

7株細(xì)菌對7種病原真菌的抑菌作用

拮抗菌 抑菌圈半徑（mm）

姜莖基腐病菌

Pmyriotylum 立枯絲核菌

R solani 小麥赤霉病菌

F graminearum 甜瓜黑斑病菌

A alternata 茄子黃萎病菌

V dahliae 煙草黑莖病菌

P parasitica 黃瓜炭疽病菌

C orbiculare

JK-19 213±06b 251±07a 199±04c 234±08bc 235±07b 188±04f 214±07b

SF-23 207±08c 167±05c 74±09e 229±05c 226±05cd 195±09e 68±04d

JK-14 219±04a 229±08bc 194±10d 241±14a 240±14a 222±06b 201±05c

JK-28 202±05cd 237±15b 202±02b 206±05e 207±05d 210±15c 229±05a

SF-19 183±10e 131±06d 64±03f 225±06d 224±08cd 207±11d 66±02de

X-11 189±05d 113±13e 207±11a 238±03b 238±05a 230±10a 62±06e

JK-25 212±02b 229±08bc 203±02b 227±04d 229±04c 211±13c 216±08b

注：表內(nèi)同列不同小寫字母表示差異顯著（P<005）。

23 拮抗菌株的形態(tài)和生理生化鑒定及16S rDNA基因序列分析

革蘭氏染色結(jié)果表明，7株拮抗菌均為革蘭氏陽性菌，在NA培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)描述見表2。

表2

7株拮抗細(xì)菌的菌落形態(tài)特征

菌株編號 顏色 透明度 粘稠度 菌落大小 形狀 表面光滑度 邊緣整齊度

X-11 黃色 不透明 不粘稠 較小 圓形 粗糙 不整齊

JK-14 乳白色 不透明 粘稠 大 圓形 光滑 整齊

SF-19 乳白色 不透明 不粘稠 大 圓形 粗糙 整齊

SF-23 黃色 不透明 不粘稠 較大 圓形 粗糙 整齊

JK-19 淺黃色 不透明 不粘稠 較大 圓形 粗糙 整齊

JK-28 淺黃色 不透明 不粘稠 較大 圓形 粗糙 整齊

JK-25 淺黃色 不透明 不粘稠 較大 圓形 粗糙 整齊

根據(jù)菌株的生理生化鑒定結(jié)果（表2），對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[11]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]進(jìn)行檢索，初步認(rèn)定X-11、JK-14、SF-19、SF-23等4株菌為芽孢桿菌屬（Bacillus） ；JK-19、JK-28、JK-25等3株菌為類芽孢桿菌屬（Peanibacillus）。

對上述菌株進(jìn)一步用細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行測定， 7個菌株中都擴增出一條約1 400 bp左右的片段。對擴增片段進(jìn)行序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已報道的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行BLAST比較，并用MEGA50軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖2），結(jié)果顯示，菌株X-11、JK-14、SF-19、SF-23與Bacillus spp位于同一分支；菌株JK-19、JK-28、JK-25與Peanibacillus spp位于同一分支。

圖2 基于16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹

結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化測定結(jié)果（表3），最終鑒定X-11為Bacillus altitudinis，JK-14、SF-19和SF-23為Bacillus pumilus；JK-19、JK-28和JK-25為Peanibacillus polymyxa。SF-19、SF-23、JK-25、JK-19、JK-28、X-11和JK-14的16S rDNA序列的GenBank登錄號分別為JQ283970、JQ283971、JQ283972、JQ283973、JQ283974、JQ283975、JQ283976和JQ283977。

24 拮抗細(xì)菌JK-14對病菌的作用機制

以姜莖基腐病菌（P myriotylum）和立枯絲核菌（R solani）為指示菌，對抑菌作用最好的菌株JK-14的抑菌機制進(jìn)行了初步分析，結(jié)果如圖3。從圖3可以看出，JK-14與P myriotylum對峙培養(yǎng)2 d后，菌絲生長受到明顯影響，菌體畸形，頂端膨脹呈囊泡狀（圖3a，白色箭頭）。部分菌絲體細(xì)胞向內(nèi)凹陷溢縮，形成橫隔膜，并最終與菌絲體其它部位脫離（圖3a、b黑色箭頭）；而對照細(xì)胞生長正常，菌絲體表面平滑，均勻，無溢縮或隔膜產(chǎn)生（圖3c）。圖3d、e是R solani的菌絲體的變化，可見菌絲體也表現(xiàn)末端膨大、姜瓣狀過度分支、分支畸形等特點（圖3d、e白色箭頭）。此外，R solani還表現(xiàn)菌絲體細(xì)胞變短、分隔增多等，有些細(xì)胞內(nèi)有明顯的紅褐色沉積物（圖3d、e黑色箭頭），而對照中菌絲體細(xì)胞無此現(xiàn)象（圖3f）。

表3 7株細(xì)菌與模式菌株的的生理生化特征比較

特征 Bacillus

subtilis X-11 JK-14 SF-19 SF-23 Peanibacillus

elgii JK-19 JK-28 JK-25

葡萄糖 + + + + + + + + +

阿拉伯糖 + + + + + + + + +

木糖 + + + + + + + +

甘露糖 + + + + + + + +

氧化酶 + + - + + + + +

接觸酶 + + + + + + + +

硝酸鹽還原 + + + + + + + + +

甲基紅 + - + + + + + +

V-P試驗 + + + + + - - - -

H2S產(chǎn)生 + + + + - - - -

吲哚產(chǎn)生 - - - - - - - - -

淀粉水解 + - + - - + + + +

明膠液化 + + + + + + + + -

七葉苷水解 - - - - - - - -

苯丙氨酸脫氨 - - - - - - - - -

50℃ - - - - - - - -

5%NaCl

（w/v） + + - + + - - - -

10%NaCl

（w/v） + - w w - - -

15%NaCl

（w/v） - - - - - - -

pH56 + w + + - - - -

注：+ ，陽性； - ，陰性； w，微弱陽性。 3 討論

Bacillus spp和 Peanibacillus spp存在于多種植物的根際，是植物根際土壤中較為普遍的微生物類群，其中的很多種類可通過分泌抗菌物質(zhì)、促進(jìn)植物生長、誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗病性等機制實現(xiàn)抗病促生作用。目前芽孢桿菌在多種植物鐮刀菌（Fusarium sp）枯萎病、Rhizoctonia sp引起的根莖病害、Sclerotinia sclerotiorum莖腐病等土傳病害的防治方面有很多研究和應(yīng)用[16～20]，其中，Bacillus subtilis中的有些菌株已在美國被登記用于草莓、葡萄、葉用蔬菜、辣椒及番茄等病害的防治（http：//wwwepagov/pesticides/biopesticides），但還未見關(guān)于芽孢桿菌在生姜上應(yīng)用的研究報道。本研究首次報道了芽孢桿菌和類芽孢桿菌對姜莖基腐病病原菌有明顯的拮抗作用，為進(jìn)一步開展生姜莖基腐病的生物防治提供了依據(jù)，對生姜莖腐病的防治有重要的應(yīng)用潛力。

芽孢桿菌在自然界中具有耐熱、耐饑餓、抗紫外線和活性氧等抗逆境能力，同時由于很多芽孢桿菌的抗菌譜廣泛，因此被認(rèn)為是植物病害生物防治理想的資源。目前已經(jīng)明確的芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)包括mycosubtilin、fengycin、bacillomycin等多種成分，這些抗菌成分不但可以抑制真菌

a、b 菌株JK-14對姜莖基腐病病原菌絲體的影響：白色箭頭表示畸形，黑色箭頭表示菌絲溢縮并形成橫隔；c對照；

d、e菌株JK-14對立枯絲核菌菌絲體影響：白色箭頭表示菌絲體畸形，黑色箭頭表示紅褐色沉積物；f對照。

圖3 拮抗菌JK-14對病原真菌菌絲體的作用菌絲體生長、孢子萌發(fā)和芽管的形成，導(dǎo)致菌絲體畸變、真菌色素的分泌等，而且可以破壞真菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜，抑制真菌DNA的合成等[20～22]。本研究中發(fā)現(xiàn)，Bacillus的JK-14菌株也可使待測真菌的無隔菌絲體出現(xiàn)菌絲溢縮并形成橫隔，菌絲體細(xì)胞頂端膨大、畸形等類似現(xiàn)象，表明JK-14可能通過類似機制抑制真菌的生長，但詳細(xì)抑菌機制仍需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植病系退休教授鄭繼法先生在細(xì)菌生理生化測定等方面給予的指導(dǎo)和幫助，并對其孜孜不倦的敬業(yè)精神致以崇高的敬意。參 考 文 獻(xiàn)：

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