海藻酸鈉固定化脂肪酶的制備及性質研究

金紅娣 王巧映 余凱 董華平

摘 要:本文采用海藻酸鈉包埋法得到了固定化脂肪酶。通過條件優(yōu)化得到了最佳固定化條件:海藻酸鈉濃度1.5%,CaCl2濃度3%,固定化時間為1h。該固定化脂肪酶連續(xù)反應4批之后,酶活保持穩(wěn)定,顯示了較好的催化穩(wěn)定性。

關鍵詞:海藻酸鈉脂肪酶固定化催化穩(wěn)定性

中圖分類號:TQ 文獻標識碼:A 文章編號:1674-098X(2012)05(b)-0142-01

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3),又稱甘油三酯水解酶,是一類能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解為甘油和長鏈脂肪酸的酶類,許多脂肪酶還能催化酯化反應酯交換反應、醇解反應、酸解反應以及氨解反應等。目前,脂肪酶已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、皮革、日用化工等行業(yè)。但游離脂肪酶穩(wěn)定性差、容易失活、難以回收利用等缺點,限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。通過固定化技術,將脂肪酶固定化在一定的載體上可以提高活力和穩(wěn)定性,而且易于回收重復使用,因此酶固定化技術被廣泛地應用,以降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率[1～2]。海藻酸鈉作為一種生物相容性較好、機械強度較高、對酶蛋白無毒副作用的高分子載體,經(jīng)常用于酶催化劑的固定化[3～4]。

本文以海藻酸鈉作為載體,制備固定化脂肪酶,并對固定化條件和酶學性質作了詳細的研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

恒流泵(蘇州江東精密儀器有限公司,BT-100B),恒溫水浴振蕩器(太倉市實驗設備廠,SHZ-88A),多能攪拌器(金壇市白塔金昌實驗儀器廠,HJ-5),分析天平(AB204-N)。

海藻酸鈉(生物級,阿拉丁試劑(上海)有限公司),牛胰脂肪酶(13-35units/mg),橄欖油(分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司),聚乙烯醇(分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司),其余試劑均為分析純。

1.2 固定化脂肪酶的制備

將海藻酸鈉加熱溶解,使海藻酸鈉最終濃度為1.5%(w/v),冷卻后使海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻,用蠕動泵滴入3.0%(w/v)的CaCl2溶液中,固定化一定時間后,濾出顆粒,用0.9%(w/v)生理鹽水洗凈后,浸在相同濃度的生理鹽水中備用。

1.3 固定化脂肪酶活性的檢測

取0.5g固定化脂肪酶加到2ml底物(按比例橄欖油∶聚乙烯醇∶緩沖液=1∶3∶5)中,于30℃下,水浴恒溫振蕩器中反應30min。反應結束后,用0.1mol/L的NaOH溶液滴定,酚酞作為指示劑。酶活定義:在反應條件下,每分鐘水解形成1μmo1脂肪酸所需酶量為1個酶活力單位(U)。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度對酶活的影響

海藻酸鈉的濃度會影響固定化酶的機械強度以及物質的在顆粒內部的擴散,進而影響催化劑的活性。如圖1所示,當海藻酸鈉濃度為1.5％時,固定化酶的活力最大,所以選擇海藻酸鈉最適濃度為1.5％。(如圖1)

2.2 CaCl2濃度對酶活的影響

將1.5%海藻酸鈉溶液與酶液混合后用蠕動泵分別滴入1,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0%(w/v)濃度的CaCl2溶液中,固定化1小時后,濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,測定固定化酶的活性,結果如圖2所示。當CaCl2濃度為3％時,固定化酶活性最高。(如圖2)

2.3 固定化時間的考察

將1.5%海藻酸鈉溶液與酶液混合后用蠕動泵滴入3%的CaCl2溶液中,分別固定化0.5、1、1.5、2、2.5、3h后,濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,測定固定化酶的活性。結果如圖3所示。有圖可知,開始固定化時,固定化酶的活性呈升高趨勢,到1h時固定化酶活達到最大;隨著固定化時間延長,固定化酶的活性又逐漸降低,這可能是因為隨著固定化時間延長,海藻酸鈉中的Na+逐漸被Ca2+替換,高分子結構致密,底物擴散阻力增加。所以固定化最佳時間為1h。(如圖3)

2.4 固定化酶批次穩(wěn)定性考察

將每一批次固定化脂肪酶反應后用蒸餾水潤洗,然后繼續(xù)進行下一批實驗,測定每一批次的固定化酶酶活。在前四批反應過程中,固定化酶的酶活保持穩(wěn)定性,第五批之后,酶活有了明顯的下降,到第7批,酶活下降為零,這可能是由于固定化顆粒崩解所致。

3 結語

本文采用直接包埋法制備了海藻酸鈉固定化脂肪酶,對固定化條件進行了優(yōu)化,得到了催化活性較高、穩(wěn)定性較好的固定化脂肪酶。

參考文獻

[1] 林繁華,張慶慶,湯斌等.聚丙烯-TiO2/CA復合膜固定化脂肪酶最佳條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2007.

[2] 王英,周劍忠,黃開紅等.固定化脂肪酶催化活性影響因素的改變對生物柴油轉化率的影響盯[J].油脂工程技術,2007.

[3] 魏靖明,張志斌,馮華林等．海藻酸鈉作為藥物載體材料的研究進展[J]．化工新型材料,2007.