三種寡核苷酸純化方法的比較

摘要：分別采用固相萃取法、電泳法、色譜法純化寡核苷酸，色譜分析結(jié)果表明產(chǎn)物純度高，固相萃取法純化后的產(chǎn)物純度低于電泳法與色譜法，但產(chǎn)量相對(duì)較大，ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果證明３種方法純化的寡核苷酸具有良好的檢測(cè)性能。在建立的固相萃取純化試驗(yàn)條件下，對(duì)３種填料純化寡核苷酸的效果、產(chǎn)量、成本進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，使用硅膠Ｃ１８和聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）填充的萃取小柱既能達(dá)到良好的純化效果又可降低成本。

關(guān)鍵詞：寡核苷酸；純化；固相萃取；電泳；色譜

中圖分類號(hào)：ＴＱ４６４．６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）14－3065-05

Comparison of Three Purification Methods for Oligonucleotides

ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ

(Textile and Chemical Engineering College, Binzhou Polytechnic, Binzhou 256603, Shandong, China)

Ａｂsｔｒａｃｔ： Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｂｉｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＰＣＲ ｔｅｓｔ， ａｌｌ ｔｈｅ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ， ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｏｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｉｌｌｅｒｓ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｏｏｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ with ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｃ１８ ａｎｄ ＰＳ／ＤＶＢ ｆｉｌｌｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ｐｕｒｉｆｙ； ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

寡核苷酸是由核苷酸通過(guò)３′，５′－磷酸二酯鍵連接而成的短鏈ＤＮＡ分子。它可作為ＰＣＲ檢測(cè)所需要的引物或探針的主要組成部分，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［１－３］。目前，中國(guó)已可使用ＤＮＡ合成儀快速合成各種序列的寡核苷酸以及熒光標(biāo)記的寡核苷酸，最常用的寡核苷酸為１０～３０ ｎｔ。以鏈長(zhǎng)為２５ ｎｔ的寡核苷酸為例，產(chǎn)物純度約為８０％～８５％，其中含有一定量的雜質(zhì)，如５′羥基不完全脫二甲氧基三苯甲烷（ＤＭＴ）保護(hù)基團(tuán)或不完全封閉羥基產(chǎn)生的非目標(biāo)序列等。這些雜質(zhì)不但造成寡核苷酸定量不準(zhǔn)，還可能影響到下一步的生物學(xué)試驗(yàn)。因此，合成后的寡核苷酸需要純化。目前大多采用的寡核苷酸純化方法有３種，分別為固相萃取法［４］、電泳法和色譜法。

研究采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的ＤＮＡ合成儀合成寡核苷酸，分別采用３種方法在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下進(jìn)行純化，比較純化效果；再應(yīng)用制備的寡核苷酸作為ＰＣＲ檢測(cè)用引物，成功地從南瓜果實(shí)中檢測(cè)到了黃瓜綠斑駁花葉病毒［５］；另外，對(duì)固相萃取法和色譜法純化寡核苷酸進(jìn)行了具體的研究。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）（粒度５０ μｍ）、ＹＭＣ*ＧＥＬ ＯＤＳ－Ａ制備色譜球形填料／硅膠Ｃ１８（平均孔徑１２ ｎｍ，粒度５０ μｍ）購(gòu)自北京慧德易科技有限責(zé)任公司，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱（貨號(hào)ＷＡＴ０９４２２６）、ＸＴｅｒｒａＴＭ ＭＳ Ｃ１８柱（５０.0 ｍｍ×４．６ ｍｍ，平均孔徑１４ ｎｍ，粒度２．５ μｍ）購(gòu)自美國(guó)Ｗａｔｅｒｓ公司，篩板、６ ｍＬ萃取柱購(gòu)自大連思譜精工有限公司，熒光薄層層析板購(gòu)自青島海洋化工廠，寡核苷酸購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所。

１．１．２試劑三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯藍(lán)、過(guò)硫酸銨（ＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、冰醋酸、三乙胺、乙腈、尿素、三氟乙酸、濃氨水等，以上均為分析純。

１．１．３主要儀器高效液相色譜儀（包括６００泵、６００控制器、７１７自動(dòng)進(jìn)樣器、２９９６光電二極管矩陣檢測(cè)器）、固相萃取裝置購(gòu)自美國(guó)Ｗａｔｅｒｓ公司，ＤＹＹ－１０Ｃ電泳儀、ＷＤ９４０３Ｅ手提式紫外燈購(gòu)自北京市六一儀器廠，ＤＵ６４０核酸蛋白分析儀購(gòu)自美國(guó)ＢＥＣＫＭＡＮ公司，ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ儀購(gòu)自美國(guó)ＡＢＩ公司，ＰＴＣ－２００梯度ＰＣＲ儀購(gòu)自美國(guó)ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司。

１．２方法

１．２．１固相萃取純化取篩板置于６ ｍＬ萃取柱底端，分別稱量１００ ｍｇ的硅膠Ｃ１８、ＰＳ／ＤＶＢ填充萃取柱，平鋪填料后，在其上面放一個(gè)篩板。以一定序列的帶ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式）為試驗(yàn)樣品，用３ ｍＬ ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ醋酸三乙胺（ＴＥＡＡｃ）溶液溶解樣品，振勻后平均分成３份，分別使用Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱、自組裝的ＰＳ／ＤＶＢ和硅膠Ｃ１８萃取小柱純化寡核苷酸，方法如下：將４ ｍＬ乙腈過(guò)柱，活化；用４ ｍＬ ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液進(jìn)行柱平衡；上樣，３～４ ｍｉｎ內(nèi)樣品在重力下通過(guò)吸附床，重復(fù)兩次上樣；用３ ｍＬ含體積分?jǐn)?shù)為１４％的乙腈的ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液沖洗短鏈的寡核苷酸，重復(fù)一遍；用３ ｍＬ去離子水洗兩遍；將３ ｍＬ體積分?jǐn)?shù)為３％的三氟乙酸加入到填料上方，其在重力下過(guò)柱，控制旋鈕，先流出１ ｍＬ的三氟乙酸，停３～５ ｍｉｎ，完成去ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)過(guò)程，觀察到吸附層變橙紅色后再重復(fù)用３ ｍＬ的三氟乙酸過(guò)柱；用３ ｍＬ去離子水洗兩遍；逐滴加入１ ｍＬ含體積分?jǐn)?shù)為１０％的乙腈的ｐＨ １１．３的０．３６ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液，控制流速為１～２ ｍＬ／ｍｉｎ，邊洗脫邊收集。定量，分裝，干燥。

１．２．２電泳純化

1）電泳。在５０ ｍＬ的１６％聚丙烯酰胺凝膠溶液中加２５０ μＬ ＡＰＳ溶液、３７．５ μＬ ＴＥＭＥＤ，迅速攪拌均勻后，倒入兩玻璃板間，插入樣梳，靜置４０～１２０ ｍｉｎ，凝固后拔掉樣梳。接通電源，設(shè)定電壓為６００ Ｖ，電泳前預(yù)熱３０ ｍｉｎ。用２００ μＬ飽和尿素溶解樣品，上樣；用含溴酚藍(lán)、二甲苯藍(lán)的飽和尿素溶液作為指示劑，在６００ Ｖ電壓下電泳，溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿１／３處停止電泳。

2）引物回收。用塑料鑷子啟開玻璃板，小心將膠置于鋪有塑料薄膜的熒光薄層層析板上。用２６０ ｎｍ波長(zhǎng)的紫外光從上方照射凝膠，用刀片切下含有目的條帶的凝膠。采用浸泡法從凝膠中回收寡核苷酸，將切下來(lái)的凝膠移入１．５ ｍＬ離心管中，擠碎，將破碎的凝膠置于加有５ ｍＬ滅菌水的１０ ｍＬ離心管中，于３７ ℃搖床中溫育過(guò)夜。離心，取上清液，干燥。

3）脫鹽。使用自組裝的硅膠Ｃ１８萃取小柱脫鹽，步驟如下：將４ ｍＬ乙腈過(guò)柱，活化；將４ ｍＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液過(guò)柱，使柱平衡；用１ ｍＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液溶解樣品，上樣；將４ ｍＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液過(guò)柱；將４ ｍＬ去離子水過(guò)柱，脫鹽；最后用１ ｍＬ體積分?jǐn)?shù)為７０％的乙腈洗脫樣品。

4）定量、分裝、干燥。

１．２．３色譜純化流動(dòng)相由ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液和乙腈溶劑組成。柱溫為６０ ℃，流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ，色譜柱為ＸＴｅｒｒａＴＭ ＭＳ Ｃ１８柱（５０．０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，粒度２．５ μｍ，平均孔徑１４ ｎｍ）。采用２５４ ｎｍ和２９０ ｎｍ雙波長(zhǎng)檢測(cè)。

１）ＤＮＡ（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ”形式）的色譜純化。對(duì)于未選擇“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式的合成（即合成的寡核苷酸不帶ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)），用濃氨水釋放寡核苷酸后離心、干燥，然后采用反相離子對(duì)色譜法進(jìn)行純化，純化后不需要去ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)，直接定量。

用２００ μＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液溶解樣品，上樣，檢測(cè)波長(zhǎng)為２５４、２９０ ｎｍ，當(dāng)檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物峰時(shí)，人工收集目標(biāo)產(chǎn)物。色譜條件見表１。用色譜純化后干燥；再用硅膠Ｃ１８萃取小柱脫鹽，定量，分裝，干燥。

２）ＤＮＡ（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式）的色譜純化。對(duì)于選擇“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式的合成（即全長(zhǎng)寡核苷酸的最后一個(gè)核苷酸保留ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)），用濃氨水釋放寡核苷酸后，離心、干燥；然后采用反相離子對(duì)色譜法進(jìn)行純化，色譜條件見表２；用色譜純化后干燥；用體積分?jǐn)?shù)為８０％的冰醋酸去ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)，靜置２０～３０ ｍｉｎ，干燥；用硅膠Ｃ１８萃取小柱脫鹽，定量，分裝，干燥。

２結(jié)果與分析

２．１色譜分析

２．１．１固相萃取純化結(jié)果分析采用表１中的色譜條件對(duì)３種小柱純化寡核苷酸后的產(chǎn)物進(jìn)行純度分析，在２６０ ｎｍ波長(zhǎng)下，當(dāng)吸光度為１時(shí)寡核苷酸濃度約為３０ μｇ／ｍＬ［６］，應(yīng)用ＤＵ６４０核酸蛋白分析儀測(cè)定適當(dāng)稀釋后的寡核苷酸的吸光度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和體積計(jì)算出純化后寡核苷酸的產(chǎn)量。由圖１Ａ、圖１Ｂ、圖１Ｃ以及表３可知，在建立的試驗(yàn)條件下，采用３種填料固相萃取純化的寡核苷酸都有少量雜質(zhì)，但是都比較純而且產(chǎn)量相近。因此，該試驗(yàn)條件適用于采用硅膠Ｃ１８、ＰＳ／ＤＶＢ純化寡核苷酸；固相萃取純化是個(gè)非常粗糙的過(guò)程，由于ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)具有強(qiáng)疏水性以及短鏈寡核苷酸的合成效率高，使得不同填料固相萃取純化的效果相差不大，采用３種填料純化后的寡核苷酸純度都很高。

２．１．２電泳純化結(jié)果分析電泳法純化一定序列的寡核苷酸（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ”形式）后，按照表１的色譜條件，在波長(zhǎng)２５４ ｎｍ下檢測(cè)純化后的產(chǎn)物。從圖２可知，雜質(zhì)峰幾乎看不到，可知電泳純化的寡核苷酸純度高。

２．１．３色譜純化結(jié)果分析由圖３可知，應(yīng)用表１的色譜條件能夠?qū)⒉粠?qiáng)疏水性ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸與雜質(zhì)分離，通過(guò)２５４和２９０ ｎｍ雙波長(zhǎng)檢測(cè)到在８～１１ ｍｉｎ出來(lái)的色譜峰在雙波長(zhǎng)檢測(cè)下吸光度最大，且峰面積最大，所以初步被判斷為目標(biāo)產(chǎn)物。收集后，在相同色譜條件下分析，圖４中僅在10～１2 ｍｉｎ出現(xiàn)惟一色譜峰，說(shuō)明在該色譜條件下能很好地純化不帶強(qiáng)疏水性ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸。由圖５可知，在表１的色譜條件下分離２０ μＬ帶有ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸，在梯度洗脫前２０ ｍｉｎ內(nèi)目標(biāo)寡核苷酸沒有分離出來(lái)，而是在２０ ｍｉｎ后，目標(biāo)寡核苷酸、部分雜質(zhì)由強(qiáng)非極性溶劑１００％乙腈一同洗脫出來(lái)，試驗(yàn)證明，由于ＤＭＴ基團(tuán)具有強(qiáng)疏水性，在反相離子對(duì)色譜柱中具有強(qiáng)保留性，因此表１中色譜條件不適用于分離具有ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸，須用非極性更強(qiáng)的流動(dòng)相洗脫。所以，采取增加流動(dòng)相Ｂ的非極性的辦法改進(jìn)色譜條件，將流動(dòng)相Ｂ中的乙腈體積分?jǐn)?shù)由１５％增加至４０％，依據(jù)公式Ｔ＝△φ／ｔＧ（Ｔ為梯度陡度，△φ為流動(dòng)相中強(qiáng)洗脫液組分Ｂ體積分?jǐn)?shù)的變化值，ｔＧ為梯度洗脫時(shí)間）計(jì)算梯度陡度（Ｔ），Ｔ減少到了１．１％／ｍｉｎ，從而保證了流動(dòng)相Ｂ在梯度洗脫時(shí)間內(nèi)保持較強(qiáng)的非極性。由圖６可知，在２５４和２９０ ｎｍ雙波長(zhǎng)檢測(cè)下，根據(jù)吸光度和峰面積判斷目標(biāo)產(chǎn)物在１４～２０ ｍｉｎ分離出來(lái)，收集后，在同樣色譜條件下分析，圖７在１４～２０ ｍｉｎ出現(xiàn)了惟一一個(gè)色譜峰，無(wú)雜質(zhì)峰，說(shuō)明在表２的色譜條件下，能夠很好地分離帶有強(qiáng)疏水性ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸。

２．２性能檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

將固相萃取、電泳及色譜純化后的寡核苷酸用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的ＲＴ－ＰＣＲ及實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ檢測(cè)，考察其檢測(cè)效果。由圖８可知，對(duì)于黃瓜綠斑駁花葉病毒的ＲＴ－ＰＣＲ試驗(yàn)，以純化后的一定序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明３個(gè)泳道均在近７５０ ｂｐ位置出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶。由圖９可知，將純化后的一定序列的寡核苷酸作為實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ檢測(cè)用引物，得到了實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ擴(kuò)增曲線，檢測(cè)到了南瓜果實(shí)中的黃瓜綠斑駁花葉病毒。說(shuō)明采用３種方法純化的寡核苷酸純度高，適用于ＰＣＲ檢測(cè)。

２．３產(chǎn)量比較試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用ＤＮＡ合成儀，以０．２ μｍｏｌ合成規(guī)模合成一定數(shù)量不同序列的２０ ｎｔ左右的寡核苷酸，應(yīng)用此次研究建立的純化條件，通過(guò)多次試驗(yàn)，總結(jié)出固相萃取純化的平均產(chǎn)量為６００～９００ μｇ；色譜純化的平均產(chǎn)量為３００～４５０ μｇ；電泳純化的平均產(chǎn)量為３００～４５０ μｇ。

３小結(jié)與討論

１）固相萃取純化寡核苷酸試驗(yàn)中，３種填料純化的產(chǎn)物濃度都較高且產(chǎn)量相差不大。３種填料各有優(yōu)缺點(diǎn)，從耐酸堿、耐用性方面比較，硅膠Ｃ１８不耐酸堿，工作ｐＨ ２～７，而聚苯乙烯－二乙烯基苯（ＰＳ／ＤＶＢ）的工作范圍為ｐＨ（工作／清洗）２～１３／１～１４，耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿，可重復(fù)使用。雖然理論上，在ｐＨ ７．５以上鍵合硅膠填料的硅基體在水溶液中易于溶解；在ｐＨ ２．０以下硅醚鏈不穩(wěn)定并且表面上的官能團(tuán)開始裂開，改變了吸附性能。然而，由于填料暴露于溶劑的時(shí)間很短，若一次使用，硅膠Ｃ１８的穩(wěn)定性是可以接受的。從價(jià)格上比較，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ＞ＰＳ／ＤＶＢ＞硅膠Ｃ１８。綜合以上的分析可知，采用固相萃取法，一次性使用自組裝的硅膠Ｃ１８或重復(fù)使用ＰＳ／ＤＶＢ萃取小柱可達(dá)到良好的純化效果，并且降低了成本。

２）對(duì)于帶有ＤＭＴ基團(tuán)的寡核苷酸的純化，由于寡核苷酸的ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)的強(qiáng)疏水作用，純化時(shí)需要用強(qiáng)非極性的洗脫液洗脫。寡核苷酸在合成時(shí)設(shè)置“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式較合適，這是因?yàn)樵谌粘９押塑账嵘a(chǎn)中，合成的序列是變化的，難以采用標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照進(jìn)行色譜定性。若為“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ”形式的合成，在合成產(chǎn)物效率高時(shí)，根據(jù)峰面積可以判斷出目標(biāo)產(chǎn)物峰；但在合成效率不高時(shí)，由于沒有明顯大面積的色譜峰，導(dǎo)致無(wú)法判斷哪個(gè)峰是目標(biāo)產(chǎn)物。而對(duì)于“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式的合成，由于全長(zhǎng)的寡核苷酸帶有強(qiáng)疏水性的ＤＭＴ保護(hù)基團(tuán)，保留時(shí)間長(zhǎng)，與其他雜質(zhì)保留時(shí)間差異大，可根據(jù)保留時(shí)間長(zhǎng)短及峰面積大小識(shí)別目標(biāo)產(chǎn)物峰。

３）比較３種方法純化產(chǎn)物的色譜分析結(jié)果，合成短片段寡核苷酸時(shí)，由于總的合成效率高，失敗序列少，色譜分析結(jié)果證明采用固相萃取法、電泳法、色譜法純化后的產(chǎn)物純度相差不大，但也有差別，固相萃取純化產(chǎn)物的色譜分析圖中有少量的面積小的雜質(zhì)峰，而電泳純化和色譜純化產(chǎn)物的色譜分析圖中幾乎沒有雜質(zhì)峰，這說(shuō)明固相萃取法純化產(chǎn)物的純度低于電泳、色譜純化的產(chǎn)物。比較３種方法純化后產(chǎn)物的產(chǎn)量，固相萃取純化的寡核苷酸的產(chǎn)量較高，而色譜純化和電泳純化的寡核苷酸的產(chǎn)量相近，純度相對(duì)高。對(duì)于純度要求高的ＰＣＲ克隆、點(diǎn)突變等分子生物學(xué)試驗(yàn)和修飾／標(biāo)記的寡核苷酸，宜選擇電泳法或色譜法純化。

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