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    離子液體[BMIM]Cl對釀酒酵母生長及其乙醛脫氫酶活性的影響

    2012-04-29 16:53:32劉洋洋童彥杰宋楊
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年15期
    關(guān)鍵詞:丁基氯化酵母

    劉洋洋 童彥杰 宋楊 等

    摘要:設(shè)置單因素試驗考察不同濃度離子液體氯化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl)對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.399生長及其乙醛脫氫酶活性的影響。結(jié)果表明,[BMIM]Cl對酵母的生長有抑制作用,且其濃度越高,抑制作用越明顯;低濃度的[BMIM]Cl可以提高酵母乙醛脫氫酶的活性,高濃度則會抑制其活性。

    關(guān)鍵詞:氯化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]Cl);酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.399;生長;乙醛脫氫酶活性

    中圖分類號:TQ209;Q142.3文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2012)15-3306-02

    Effects of Ionic Liquid 1-Butyl-3-Methylimidazolium Chlorine on Growth and Aldehye Dehydrogenase Activity of Saccharomyces cerevisiae

    LIU Yang-yang1,TONG Yan-jie2,SONG Yang2,ZHANG Rui2,ZHU Sheng-dong2,WU Yuan-xin1,2

    (1.State Key Laboratory of Agriculture Microbiology, Huazhong Agriculture University,Wuhan 430070, China;

    2. School of Chemical Engineering and Pharmacy, Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073, China)

    Abstract: The effects of ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium chlorine([BMIM]Cl) on growth and aldehye dehydrogenase(ALDH) activity of Saccharomyces cerevisiae AS2.399 were studied by signal factor tests. The results indicated that [BMIM]Cl could inhibit the growth of yeast. The higher the[BMIM]Cl concentration, the more obvious the inhibition effect was. The activity of ALDH could be promoted by low concentration of [BMIM]Cl while inhibited by high concentration.

    Key words: 1-butyl-3-methylimidazolium chlorine([BMIM]Cl); Saccharomyces cerevisiae AS2.399; growth; ALDH activity

    離子液體(Ionic liquids,ILs)是指在室溫或者接近于室溫下呈液態(tài)的由離子構(gòu)成的有機鹽[1]。離子液體作為一種新型有機溶劑,具有無可測蒸汽壓、可循環(huán)使用、對空氣無污染等優(yōu)點[2,3],已被成功地應(yīng)用到化學(xué)合成、化學(xué)分離以及電化學(xué)等方面[4]。隨著離子液體在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用,其自身的綠色性也越來越受到關(guān)注,如其在自然界和生物體內(nèi)如何降解,累積度對生物體的毒性如何等[5]。乙醛脫氫酶又稱醛脫氫酶,是一類依賴NAD(P)的氧化還原酶,可催化乙醛或其他醛類轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的酸類[6,7],能緩解飲酒后大量乙醇代謝成乙醛對人體造成的毒害[8],是近年來研究的熱點[9,10]。本研究以實際生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的離子液體氯化1-丁基-3-甲基咪唑鹽([BMIM]Cl)為研究對象,考察其對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.399生長及其乙醛脫氫酶活性的影響,為離子液體的推廣應(yīng)用及安全性鑒定提供一定的理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料與儀器

    釀酒酵母AS2.399為武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院412實驗室保藏菌株。實驗用離子液體[BMIM]Cl購自河南利華制藥公司;其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;生物培養(yǎng)基購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。One shot高壓細胞破碎儀(Constant Systems);UV-2102PC型紫外分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司);UNIVERSAL 32R臺式冷凍離心機(德國Hettich公司)。

    1.2方法

    1.2.1[BMIM]Cl對酵母菌體生長的影響分別配制[BMIM]Cl濃度為0.001、0.100、2.000、5.000、25.000、50.000和100.000 mg/mL的YPD液態(tài)培養(yǎng)基,接種后培養(yǎng)基OD600 nm=0.125,培養(yǎng)至菌體生長到一定濃度時取樣(接種后每隔2~3 h取樣,具體根據(jù)菌體生長情況決定,下同)并測定其在600 nm處的吸光度。

    1.2.2[BMIM]Cl對酵母乙醛脫氫酶活性的影響將酵母接種到添加了不同濃度[BMIM]Cl的YPD培養(yǎng)基中,每隔2~3 h取樣測OD600 nm,并稀釋到OD600 nm=1.000,用高壓細胞破碎儀將其破碎,4 ℃下12 000 r/min離心5 min,?。常埃?μL上清液加入酶活反應(yīng)體系(20 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.10 mL、1 mol/L Tris-HCl 0.30 mL(pH 8.0)、1 mol/L巰基乙醇 0.05 mL、100 mmol/L乙醛0.10 mL、3 mol/L KCl 0.10 mL;雙蒸水2.05 mL),立即測試其在340 nm處的吸光度。

    1.2.3對數(shù)生長期添加[BMIM]Cl對酵母生長的影響將酵母菌體接種到YPD培養(yǎng)基中,初始OD600 nm=0.125,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后分裝到不同的無菌培養(yǎng)瓶中,添加50 μL含不同濃度[BMIM]Cl的YPD培養(yǎng)基。每隔2~3 h取樣并測其OD600 nm。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同濃度[BMIM]Cl對酵母菌體生長的影響

    如圖1所示,酵母AS2.399的生長曲線隨著[BMIM]Cl濃度的不同而變化,[BMIM]Cl會使菌體提前進入穩(wěn)定期,從而降低培養(yǎng)基中的菌體濃度。[BMIM]Cl濃度越高,其對菌體生長的影響越大,菌體越早進入穩(wěn)定期。當[BMIM]Cl濃度達到100.000 mg/mL時,菌體的生長被嚴重抑制,在培養(yǎng)基中濃度的增幅很小。[BMIM]Cl濃度為0.001、0.100、2.000、5.000、25.000、50.000和100.000 mg/mL時,培養(yǎng)40 h 后培養(yǎng)基中菌體的濃度分別為對照組的92%、75%、64%、57%、38%、31%、8%。

    2.2[BMIM]Cl對酵母乙醛脫氫酶活性的影響

    為保證酵母菌體的濃度相同,以反映單個細胞內(nèi)乙醛脫氫酶活性的差異,將測試酶活的樣品稀釋到相同的濃度(OD600 nm=1.000)。如圖2所示,不同濃度的[BMIM]Cl對菌體乙醛脫氫酶活性的影響不同。低濃度(0.001、0.100 mg/mL)的[BMIM]Cl下菌體的乙醛脫氫酶活性比對照有所升高,但當[BMIM]Cl濃度大于2.000 mg/mL時,菌體的乙醛脫氫酶活性受到抑制,并且隨著其濃度的升高,抑制作用越明顯。

    2.3對數(shù)生長期添加[BMIM]Cl對酵母菌體生長的影響

    當酵母菌體生長到對數(shù)期時,添加不同濃度的[BMIM]Cl以考察其對菌體生長的影響。由圖3可知,[BMIM]Cl對菌體的生長有明顯的影響,其不同的濃度對菌體有不同程度的生物毒性。[BMIM]Cl濃度小于1.000 mg/mL時,其對菌體的生長有抑制作用,但此時菌體尚未出現(xiàn)生長停滯狀態(tài);而[BMIM]Cl濃度為50.000 mg/mL時,其嚴重抑制了菌體的生長,菌體的生長基本處于停滯狀態(tài)。

    3結(jié)論

    培養(yǎng)基中添加不同濃度的[BMIM]Cl對釀酒酵母AS2.399的生長有抑制作用,觀察發(fā)現(xiàn)高濃度的[BMIM]Cl處理比對照組中存在更多的死酵母。因此,在[BMIM]Cl大規(guī)模使用的工業(yè)化生產(chǎn)中,必須先對廢液進行處理后才能排放,否則會對周邊環(huán)境中的微生物造成毒害作用,從而破壞生態(tài)平衡。低濃度的[BMIM]Cl對酵母乙醛脫氫酶的活性有促進作用,可能是因為菌體在[BMIM]Cl脅迫下的一種自我保護措施。然而高濃度的[BMIM]Cl具有生物毒性,會對菌體產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞作用。

    參考文獻:

    [1] 李磊,李丹丹,劉雪鋒. 烷基咪唑型離子液體與牛血清白蛋白的相互作用研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2012,23(11):1447-1455.

    [2] 童彥杰,王啟軍,馬亞麗,等. 離子液體[BMIM]Cl對土壤理化性質(zhì)及其微生物的影響[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報,2011,33(8):25-29.

    [3] ZHU S, WU Y, CHEN Q, et al. Dissolution of cellulose with ionic liquids and its application:A mini-review[J].Green Chem, 2006,8(4):325-327.

    [4] 鄭燕升,莫倩. 離子液體工業(yè)化應(yīng)用及關(guān)鍵技術(shù)問題[J].化工新型材料,2010(3):16-18.

    [5] 駱愛蘭,何建玲.離子液體脅迫下土壤蔗糖酶活性[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報,2011,27(30):88-92.

    [6] MOON K H, ABDELMEGEED M A, SONG B J. Inactivation of cytosolic aldehyde dehydrogenase via S-nitrosylation in ethanol-exposed rat liver[J]. FEBS Letters,2007,581(21):3967-3972.

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    [8] 趙錦,趙玉鳳,黃錕,等.人乙醛脫氫酶2基因在畢赤酵母中的高效表達[J].化學(xué)與生物工程,2010(2):50-52.

    [9] 黃瑞,王璐,沈微,等. 釀酒酵母乙醛脫氫酶的克隆與表達[J].工業(yè)微生物,2009,39(1):22-27.

    [10] 張鴻達,劉成,高衛(wèi)華,等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丙酸的研究進展[J].化工進展,2007,26(1):33-36.

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