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    D型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素遺傳變異分析

    2012-04-29 00:44:03冶貴生
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年15期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異毒素

    冶貴生

    摘要:研究D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)青海分離株ε毒素基因的遺傳變異特點(diǎn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ε毒素基因,目的基因片段大小為888 bp。建立PCR反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)、純化、測(cè)定核苷酸序列,與參考序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。結(jié)果表明,目的基因擴(kuò)增良好,分離菌株WC-epsilon-FL與菌株C60-3、NCTC 8346、Mukteshwar、AJ250956的核苷酸序列的同源性依次為99.9%、99.8%、98.9%、99.4%。

    關(guān)鍵詞:D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens);ε毒素;遺傳變異

    中圖分類號(hào):S852文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)15-3183-03

    Genetic Variation of ε Toxin of Clostridium perfringens Type D Isolated from Qinghai

    YE Gui-sheng

    (Department of Veterinary, College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016,China)

    Abstract: In order to research genetic variation of ε toxin gene of Clostridium perfringens type D isolated from Qinghai,primers of which PCR product length was 888 bp was designed to amplify ε toxin gene. Amplification product was detected by electrophoresis, and purified and sequenced; then its homology with reference sequences was analyzed. The results indicated that toxin gene were amplified very well, nucleotide sequence homology rate was 99.9%、99.8%、98.9%、99.4% between Qinghai isolated strain and strain C60-3, strain NCTC 8346, strain Mukteshwar, strain AJ250956 ,respectively.

    Key words: Clostridium perfringens type D; ε toxin; genetic variation

    產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌,是一種人畜共患病的革蘭氏陽性菌,產(chǎn)芽胞,在自然界分布極廣,土壤、飼料、蔬菜等均有分布。產(chǎn)氣莢膜梭菌分型較多,其中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè),其引起的疾病為羊腸毒血癥,該病潛伏期短,發(fā)病快,死亡快[1]。D型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α和ε兩種毒素,其中α毒素具有磷脂酶的活性[2],ε毒素前體被激活后會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性并增加血管滲透性[3]。青海地處青藏高原,是我國重要的牧區(qū)之一,綿羊養(yǎng)殖業(yè)在青海牧區(qū)養(yǎng)殖業(yè)中所占比重較大,鑒于產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病特點(diǎn),該菌對(duì)青海省養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成一定程度的威脅,因此,本研究通過測(cè)定并分析D型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素基因的核苷酸變異特點(diǎn),旨在為青海省產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌為臨床分離并保存于青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2試劑Taq DNA聚合酶為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品,細(xì)菌基因組提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品、DNA Marker?yàn)閷毶铮ù筮B)有限公司產(chǎn)品,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基為北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

    1.1.3引物根據(jù)NCBI上登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,預(yù)期目的片段大小為888 bp。上游引物:5′-AAGGAAATATCTAATACAGTATCTAATG-3′;下游引物:5′-TTTTATTCCT

    GGTGCCTT-3′。

    1.2方法

    1.2.1增菌培養(yǎng)按培養(yǎng)基說明書配制,無菌操作進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的厭氧培養(yǎng)。

    1.2.2DNA提取參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.2.3毒素基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、模板 1 μL,Taq DNA聚合酶 0.5 μL、補(bǔ)滅菌水至50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),然后72 ℃ 10 min,4 ℃ 保存。

    1.2.4擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)束后?。?μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

    1.2.5序列分析將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序并進(jìn)行同源性分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1ε毒素基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)

    ε毒素基因所在泳道2出現(xiàn)目的條帶,目的基因條帶清晰,表明擴(kuò)增效果良好(圖1)。

    2.2ε毒素基因核苷酸序列分析

    應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)所測(cè)菌株ε毒素基因核苷酸進(jìn)行分析,結(jié)果表明(表1)所測(cè)青海分離株ε毒素基因A+T含量較高,其堿基組成含有較多的腺嘌呤和胸腺嘧啶。

    2.3ε毒素基因核苷酸序列同源性分析

    選擇NCBI登錄的4株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(菌株C60-3、NCTC 8346、Mukteshwar、AJ250956)的ε毒素基因與所測(cè)青海分離菌株WC-epsilon-FL進(jìn)行同源比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果表明,菌株WC-epsilon-FL的ε毒素基因與參考菌株核苷酸序列同源性依次為99.9%、99.8%、98.9%、99.4%(圖2),所測(cè)菌株與菌株 C60-3之間有1處核苷酸突變;與菌株 NCTC 8346之間有2處核苷酸突變;與菌株Mukteshwar之間有5處核苷酸突變;與菌株AJ250956有2處核苷酸突變(圖3)。

    3討論

    D型產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生α和ε兩種毒素,毒素是該菌致病的主要因素,ε毒素編碼基因位于細(xì)菌大質(zhì)粒上,當(dāng)細(xì)菌侵入宿主體內(nèi)后ε毒素以前體形式被分泌出來,在腸道內(nèi)毒素前體的N端和C端部分氨基酸被腸道內(nèi)的蛋白酶切除后轉(zhuǎn)變成有活性的毒素,從而造成機(jī)體組織器官的損傷。ε毒素可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并在膜上形成孔隙從而造成細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的變化,進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。本研究所測(cè)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌青海分離株ε毒素基因長度為888 bp,從ε毒素基因序列同源性分析結(jié)果來看,菌株WC-epsilon-FL與菌株C60-3親緣關(guān)系最近;與菌株NCTC 8346和菌株 AJ250956的親緣關(guān)系次之;與菌株 Mukteshwar親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。另外,從ε毒素基因序列同源性比對(duì)結(jié)果可知,菌株WC-epsilon-FL與菌株C60-3之間1處的核苷酸突變,為C-A突變;與菌株NCTC 8346之間的2處核苷酸突變,均為C-A突變;與菌株Mukteshwar之間的5處核苷酸突變,分別為2處T-G突變、1處T-A突變、1處G-A突變和1處A-T突變;與菌株AJ250956的2處突變?yōu)椋牵镣蛔兒停粒酝蛔儯鲜鐾蛔兙鶠辄c(diǎn)突變,這說明D型產(chǎn)氣莢膜梭菌可通過ε毒素基因的變異來適應(yīng)不同的地域環(huán)境,通過遺傳變異加強(qiáng)自身適應(yīng)不同生存環(huán)境的能力。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 陳敷言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 第五版.北京,中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.315-316.

    [2] ROOD J I,MCCLANE B A,SONGER J G,et al. The Closrridia: Molecular Biology and Pathogenesis[M]. New York: Academic Press,1997.223-242.

    [3] MIYALMOTO O, MINAMI J, TOYOSHIMA T, et al. Neurotoxicity of Clostridium perfringens epsilon toxin for the rat hippocampus via the glutamatergic system[J]. Infect Immun, 1998,66(6):2501-2508.

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