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    適用于SSR—PCR試驗(yàn)的水稻基因組DNA提取方法的比較

    2012-04-29 09:07:53王婧楊潔等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年24期
    關(guān)鍵詞:提取方法基因組水稻

    王婧 楊潔等

    摘要:為了尋找操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的適用于簡(jiǎn)單重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(SSR-PCR)試驗(yàn)的水稻基因組DNA提取方法,試驗(yàn)以3種類型的水稻樣品(葉片、米粒、米粉)為材料,比較了十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、試劑盒法、蔗糖法、堿法4種基因組DNA提取方法對(duì)水稻基因組DNA提取質(zhì)量的影響。結(jié)果表明,CTAB法提取的葉片、米粒和米粉的基因組DNA含量最高,其次為試劑盒法提取的葉片、米粉和堿法提取的米粉的基因組DNA含量。通過(guò)4種方法得到的水稻基因組DNA純度均不高,但不影響后續(xù)的SSR-PCR試驗(yàn)。SSR-PCR結(jié)果表明,CTAB法、試劑盒法和堿法提取的3種樣品類型的水稻基因組DNA的擴(kuò)增均表現(xiàn)出了良好的重復(fù)性。其中試劑盒法的提取成本最高,CTAB法耗時(shí)最長(zhǎng)。整體而言,堿法是最適合水稻SSR-PCR試驗(yàn)的基因組DNA提取方法,且以米粉為提取材料時(shí)效果最佳。

    關(guān)鍵詞:水稻;基因組DNA;提取方法

    中圖分類號(hào):S511;Q523;Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2012)24-5794-04

    水稻(OryzasativaL.)是世界上三大糧食作物之一,中國(guó)的稻田面積占世界稻田面積的22%[1]。在水稻和其他大多數(shù)作物中,以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記分析如簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simplesequencerepeat,SSR)標(biāo)記由于其具有多態(tài)性好、可靠性高、技術(shù)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜和DNA模板使用量低等優(yōu)點(diǎn),在分子生物學(xué)技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用。DNA提取是SSR-PCR分析的前提。在這一研究中,往往要對(duì)幾十個(gè)乃至幾百個(gè)樣品提取的基因組DNA進(jìn)行SSR分析。這就需要進(jìn)行大量的DNA提取工作,而常規(guī)DNA提取過(guò)程比較復(fù)雜,是分子標(biāo)記分析效率提高及成本降低的關(guān)鍵性因素[2]。事實(shí)上,針對(duì)SSR的PCR技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求不是很高,運(yùn)用一些簡(jiǎn)單快速的方法獲得的基因組DNA就可以滿足其需要。因而發(fā)展簡(jiǎn)便快速提取基因組DNA的方法就顯得尤為重要。目前,國(guó)內(nèi)外已建立了多種基因組DNA的提取方法,這些方法因所研究的對(duì)象和目的不同而有一定的差異,主要是十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)法、堿法和蔗糖法等,并且多數(shù)方法是基于葉片的基因組DNA提取為前提[3-7],所以基于種子基因組DNA的提取方法也日益受到研究者的重視[8],但基于米粉的基因組DNA提取方法卻鮮有報(bào)道。試驗(yàn)比較了以3種類型的水稻樣品(葉片、米粒、米粉)為材料的4種基因組DNA提取方法(CTAB法、試劑盒法、蔗糖法、堿法)提取的基因組DNA濃度和質(zhì)量,并分析了SSR-PCR檢測(cè)結(jié)果,試圖找出操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的水稻基因組DNA提取方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    水稻品系為K478、K480、K482,由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供;將試驗(yàn)里進(jìn)行基因組DNA提取的樣品類型分為3類:A,正常條件下發(fā)芽7d的水稻幼嫩葉片樣品;B,單株種子樣品;C,1粒去殼的水稻種子經(jīng)植物球磨儀研磨后所得到的米粉樣品。

    1.2 DNA提取方法

    1.2.4 方法4 參考植物基因組DNA提取試劑盒的操作手冊(cè)里提取與純化基因組DNA的有關(guān)方法,將3種樣品進(jìn)行相關(guān)處理,得到可以用做PCR模板的材料溶液。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)水稻基因組DNA純度與含量

    2.2 SSR-PCR擴(kuò)增

    以4種方法提取不同材料類型的3個(gè)水稻品系DNA為模板,選?。矊?duì)SSR引物RM336和RM297擴(kuò)增水稻的DNA樣品,結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。從圖1、圖2可見(jiàn),4種方法提取的水稻基因組DNA大多數(shù)都擴(kuò)增出了電泳條帶,雖然不同樣品的質(zhì)量及濃度明顯不同,而且所有樣品都存在不同程度的污染現(xiàn)象,但這些因素顯然沒(méi)有對(duì)PCR擴(kuò)增造成明顯的影響。引物RM336和RM297擴(kuò)增的帶型在某些樣品間存在一定差異,能夠反映出這些樣品的基因型不同,說(shuō)明4種方法提取的水稻基因組DNA完全能滿足SSR-PCR分析的需要,可用于種子真實(shí)性和純度的快速鑒定。其中CTAB法、堿法和試劑盒法提取不同材料類型的水稻基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果都得到了較好地重復(fù),說(shuō)明這3種方法提取的水稻基因組DNA用于SSR-PCR試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定;而蔗糖法的擴(kuò)增成功率則低于其他3種方法,說(shuō)明蔗糖法提取的水稻基因組DNA含量偏低。

    2.3 4種DNA提取方法的成本分析

    3 小結(jié)與討論

    SSR分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn),因此在作物品種純度鑒定[13]、遺傳多樣性分析[14]等方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。雖然SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)模板DNA純度和含量的要求不高,但是高質(zhì)量的DNA是檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠并有較高重復(fù)性的有力保障。目前,DNA提取方法種類繁多,有傳統(tǒng)的SDS法、CTAB法,簡(jiǎn)化后的堿法和蔗糖法等,但在效率上仍然有改進(jìn)的空間。尤其是對(duì)大批量的水稻樣品進(jìn)行SSR分析時(shí),需要尋找一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低且又能保證擴(kuò)增質(zhì)量的最適水稻基因組DNA提取方法。因此有必要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化和比較各種提取方法。

    通過(guò)比較CTAB法、試劑盒法、蔗糖法、堿法提取的水稻基因組DNA,發(fā)現(xiàn)以CTAB法提取的水稻葉片、米粒和米粉的水稻基因組DNA含量最高,其次是試劑盒法提取的葉片、米粉和堿法提取的米粉的水稻基因組DNA含量較高,反映出最大限度地使水稻樣品均勻分散而得到的米粉樣品成為了提?。模危磷罴训牟牧闲螒B(tài)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)4種方法提取的DNA純度均不高,其中以試劑盒法和CTAB法較好,原因可能是堿法和蔗糖法在提取DNA?xí)r只保留了裂解組織、DNA沉淀和溶解等主要步驟,而摒棄了蛋白質(zhì)和有機(jī)物清除等中間步驟,導(dǎo)致提取的DNA中存在蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)物小分子等物質(zhì)的污染,進(jìn)而降低了純度。SSR-PCR結(jié)果顯示,CTAB法、試劑盒法和堿法提取不同類型材料的DNA擴(kuò)增結(jié)果都得到了很好地重復(fù),說(shuō)明這3種方法提取的DNA用于SSR試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。但其中試劑盒法的提取成本很高,提取每100個(gè)樣品的成本高達(dá)572.08元,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余3種方法;而CTAB法耗時(shí)很長(zhǎng),提取每個(gè)樣品的時(shí)間是耗時(shí)最短的堿法的7倍左右。

    綜上可知,堿法提取水稻基因組DNA是4種方法中性價(jià)比最高的方法,尤其以米粉作為材料提取DNA效果最佳。該方法制備模板操作時(shí)間短、效率高、重復(fù)性好、成本低,并且制備過(guò)程無(wú)需使用有機(jī)溶劑,可避免有機(jī)試劑對(duì)人體的毒害作用。因此,用堿法快速地從大量樣本中提取水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可廣泛地應(yīng)用于水稻基因組DNA分子標(biāo)記相關(guān)的科學(xué)試驗(yàn)及生產(chǎn)實(shí)踐中。

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