心肌營(yíng)養(yǎng)素—1在急性肝衰竭大鼠中的動(dòng)態(tài)變化

潘珍珍　陳永平　潘陳為

[摘要] 目的 觀察心肌營(yíng)養(yǎng)素-1（CT-1）在急性肝衰竭大鼠中的動(dòng)態(tài)變化及意義探討。 方法 大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）建立急性肝衰竭模型，在造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h分別留取肝組織，用RT-PCR法檢測(cè)肝臟CT-1mRNA的表達(dá)，并用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)環(huán)氧化酶-2（COX-2）蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 CT-1在正常大鼠中表達(dá)很少，造模后12 h開始表達(dá)增多（P < 0.05），于48 h時(shí)達(dá)高峰值，隨后逐漸下降； COX-2在正常組未見蛋白表達(dá)，造模后6 h表達(dá)量逐漸增多，至48～72 h時(shí)達(dá)高峰。 結(jié)論 CT-1參與了D-Gal誘導(dǎo)的肝衰竭模型的發(fā)生發(fā)展，有可能為急性肝衰竭的治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 心肌營(yíng)養(yǎng)素-1；急性肝衰竭；環(huán)氧化酶-2

[中圖分類號(hào)] R575[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）32-0001-03

心肌營(yíng)養(yǎng)素-1（cardiotrophin-1，CT-1）是Pennica D等[1]于1995年發(fā)現(xiàn)的IL-6家族新成員，它具有廣泛的生物活性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CT-1 在多種肝損傷的動(dòng)物模型中發(fā)揮著較好的保護(hù)作用，促進(jìn)肝細(xì)胞再生作用。急性肝衰竭（acute liver failure， ALF）是由于肝細(xì)胞大量壞死而導(dǎo)致肝功能嚴(yán)重受損為特征的綜合征，因此如何減少肝細(xì)胞的凋亡和壞死、促進(jìn)殘存肝細(xì)胞再生，是改善急性肝衰竭患者預(yù)后的重要因素。本實(shí)驗(yàn)通過建立急性肝衰竭大鼠模型，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)肝組織中CT-1的表達(dá)，并結(jié)合肝功能、COX-2的相應(yīng)變化以探討CT-1在急性肝衰竭中的作用。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

RT-PCR試劑盒（晶美生物公司），引物由上?；倒竞铣桑椒庖呓M化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，PV-6001），COX-2單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZA-0515），D-Gal（重慶醫(yī)科大學(xué)生物工程研究室，批號(hào)20041018）。

1.2 動(dòng)物模型及分組

雄性SD大鼠，48只，體重200 g左右（溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分成2組。A組（肝衰竭模型組42只）：將10%的D-氨基半乳糖按1.4 g/kg劑量腹腔注射，建立肝衰竭模型。分別于造模后的6、12、24、48、72、120、168 h 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死6只大鼠，取血及肝組織。B組（正常對(duì)照組6只）：按1.4 g/kg劑量生理鹽水腹腔內(nèi)注射，記為0 h，取血及肝組織。

1.3 肝功能檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平。

1.4 COX-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)及HE染色

用10%中性甲醛固定的肝組織，石蠟包埋，4 μm病理切片，按說明書進(jìn)行免疫組化染色及HE染色，COX-2免疫組化結(jié)果使用美國(guó)IPP5.0（Image Pro-plus 5.0）專業(yè)圖像分析軟件測(cè)定平均光密度值，用陽性部位的光密度值減去背景的光密度值，即為陽性部位的吸光度值。

1.5 CT-1mRNA表達(dá)的檢測(cè)

按Trizol試劑盒說明提取RNA，用半定量RT-PCR測(cè)定肝組織CT-1mRNA的表達(dá)。三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。GAPDH引物：上游 5'-ACCACAGTCCATGCCAT-3'，下游：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物452bp。CT-1引物：上游5'-GCCAAGATCCGACAGACAC -3'，下游：5'- GC ACAGCATCCAATAGCG-3'，產(chǎn)物241bp。PCR擴(kuò)增參數(shù)：95℃5 min；94℃ 30 s；56℃ 45 s；72℃ 40 s；35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并用100bp Ladder Marker 作分子量標(biāo)準(zhǔn)，在凝膠成像系統(tǒng)顯像，用Gel-Pro 3.1軟件半定量分析不同時(shí)相CT-1/GAPDH灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD-T法，方差不齊者進(jìn)行Dunnets T3法。P < 0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能ALT、AST水平變化

肝衰竭模型組大鼠ALT、AST造模后6 h就開始上升（P < 0.05），于48～72 h達(dá)高峰值，此后逐漸下降。見表1。

2.2 HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。肝衰竭模型組在造模后24～48 h發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞廣泛壞死，肝索解離，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，殘存肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的水腫變性，中央靜脈匯管區(qū)及壞死區(qū)有巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1、圖2。

2.3 COX-2蛋白的檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組未見COX-2蛋白表達(dá)，肝衰竭模型組在造模后6 h表達(dá)量逐漸增多（P < 0.05），至48～72 h時(shí)達(dá)高峰，較24 h有明顯增多，以中央靜脈匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達(dá)最為明顯。見表2、圖3、圖4。

2.4 CT-lmRNA的檢測(cè)結(jié)果

正常大鼠肝細(xì)胞中CT-1mRNA表達(dá)很少，肝衰竭模型組在造模后12 h開始明顯增多，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），于48 h時(shí)達(dá)高峰值，隨后逐漸下降。見表2，圖5。

3 討論

急性肝衰竭（ALF）是肝細(xì)胞廣泛變性、壞死引起肝功能嚴(yán)重?fù)p害的臨床綜合征，病死率極高，因此成功建立急性肝衰竭動(dòng)物模型是研究ALF的基本條件。在本實(shí)驗(yàn)中，通過腹腔注射1.4 g/kgD-氨基半乳糖誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠，結(jié)合肝功能ALT、AST變化及HE染色結(jié)果，說明ALF模型的成功建立。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，CT-1在多種肝損傷的動(dòng)物模型中發(fā)揮著較好的保護(hù)作用，但國(guó)內(nèi)外尚無關(guān)于CT-1在D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的ALF動(dòng)物肝組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，通過動(dòng)態(tài)觀察大鼠肝組織中CT-1mRNA的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝衰竭模型組CT-1的變化趨勢(shì)與AST、ALT相同，表明了CT-1參與了D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的肝衰竭模型的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CT-1mRNA在正常組表達(dá)很少，肝衰竭模型組在造模后12 h開始增多，于48 h時(shí)達(dá)高峰值，在168h仍高于正常對(duì)照組。這與Bustos M等[2]研究的肝再生模型中的表現(xiàn)稍有區(qū)別，后者是通過肝大部分切除構(gòu)建肝衰竭，CT-1表現(xiàn)為造模后24 h達(dá)到高峰，于144 h回到基礎(chǔ)水平，這可能同兩種建模方法所致的肝衰竭機(jī)制不同有關(guān)。Inguez M等[3]研究發(fā)現(xiàn)在肝臟缺血再灌注損傷中，缺血損傷可見CT-1表達(dá)，隨肝細(xì)胞損傷程度加重而表達(dá)增多，并且非缺血部位其表達(dá)更加明顯。同時(shí)實(shí)驗(yàn)前預(yù)先靜脈注射CT-1，可以抑制缺血再灌注造成的肝損傷，這提示內(nèi)源性與外源性CT-1均具有明顯的肝臟保護(hù)作用。CT-1基因敲除小鼠肝臟更容易遭受Fas因素誘導(dǎo)的凋亡打擊。外源性CT-1對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的大鼠和小鼠肝炎模型有良好的保護(hù)作用[4]。但目前CT-1保護(hù)肝細(xì)胞的機(jī)制尚不十分清楚。

環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為重要活性物質(zhì)前列腺素初始步驟的關(guān)鍵限速酶。最近的一些研究顯示COX-2在炎癥的開始和治療階段均有作用。Tsukada 等發(fā)現(xiàn)COX-2在肝表達(dá)，并且在肝損傷時(shí)上調(diào)，同時(shí)使用選擇性COX-2抑制劑，可使肝損傷加重[5]。國(guó)外有報(bào)道在臨床使用非類固醇類抗炎藥抑制COX-2活性和前列腺素的產(chǎn)生從而導(dǎo)致了肝損傷。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明正常對(duì)照組未見COX-2蛋白表達(dá)，造模后6 h表達(dá)量逐漸增多，至48～72 h時(shí)達(dá)高峰，以中央靜脈匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達(dá)最為明顯。并且結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2與CT-1的變化趨勢(shì)相一致，并略早于CT-1的升高，這提示了可能與COX-2刺激CT-1表達(dá)有關(guān)。Beraza等[6]研究也證明了COX-2與肝細(xì)胞再生之間以及與CT-1之間的聯(lián)系，并指出肝部分切除不久后COX-2的激活和前列腺素的產(chǎn)生是對(duì)于肝增殖及CT-1的正確誘導(dǎo)是必須的。

本實(shí)驗(yàn)研究表明CT-1參與了急性肝衰竭大鼠的發(fā)生發(fā)展，可能參與肝臟再生作用，有可能為急性肝衰竭的治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，但有關(guān)其具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Pennica D，King KL，Shaw KJ，et al. Expression cloning of cardiotropin-1，a cytokine that induces cardiac myocyte hypertrophy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（4）：1142-1146.

[2]Bustos M，Beraza N，Lasarte JJ， et al. Protection against liver damage by cardiotrophin-1：a hepatocyte survival factor up-regulated in the regenerating liver in rats[J]. Gastroenterology，2003，125（1）：192-201.

[3]Inguez M，Martinez-Anso E，Beraza N，et al. Cardiotrophin-1 efficiently protects the liver against ischemia-reperfusion （I/R）injury[J]. Journal of Hepatology，2004，40（1）：48.

[4]Marques JM，Belza I，Holtmann B，et al. CardiotroPhin-1 is an Essential faetor in the natural defense of the liver against apoptosis[J]. Hepatology， 2007，45（3）：639-648.

[5]Tsukada K，Hasegawa T，Tsutsumi S，et al. Roles of cyclooxygenase-2 in tissue injury during hemorrhagic shock[J]. Shock，2000，13（5）：392-397.

[6]Beraza，Margués JM，Martínez-Ansó E，et al. Interplay among gardiotrophin-1，prostaglandins，and vascular endothelial growth factor in rat Liver regeneration[J]. Hpatology，2005，41（3）：460-469.

（收稿日期：2012-09-03）