缺氧誘導因子-1α在垂體腺瘤中的表達及其臨床意義

李 強，莫業(yè)和，劉運生

垂體腺瘤是臨床常見的顱內腫瘤，絕大多數(shù)呈組織學良性表現(xiàn)，但仍有一部分呈侵襲性生長，導致手術完全切除困難，術后容易復發(fā)，目前仍是臨床治療的難點和重點。缺氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α) 是普遍存在于人和哺乳動物細胞內的缺氧應答調控因子，在調節(jié)缺氧誘導的基因表達中發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的侵襲和轉移密切相關［1］。本研究通過檢測HIF-1αmRNA和蛋白在垂體腺瘤中的表達情況，探討HIF-1αmRNA和蛋白的表達與垂體腺瘤侵襲性的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集2006年4—9月中南大學湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科垂體腺瘤手術標本42例，其中男20例，女22例;年齡16～60歲，平均40．6歲，均經(jīng)手術和病理學確診。鞍膈或鞍底硬腦膜送病理學檢查，明確是否存在腫瘤細胞浸潤。腫瘤最大直徑11～20 mm者7例，21～30 mm者14例，31～40 mm者9例，＞40 mm者12例。符合下列情況之一者可確定為侵襲性垂體腺瘤:(1)Hardy-Wilson分級為Ⅲ級及Ⅲ級以上和C-E期;(2)Knosp分級3級以上;(3)術中見鞍區(qū)骨質破壞，海綿竇內壁穿通，竇內結構被腫瘤包繞;(4)病理證實鞍膈或鞍底硬腦膜有腫瘤細胞侵潤。42例患者中侵襲性垂體腺瘤27例 (64．3%)，非侵襲性腺瘤15例 (35．7%)。

1．2 方法

1．2．1 標本處理 腫瘤標本均取自腫瘤中心部位。取綠豆大小腫瘤標本數(shù)塊，0．9%氯化鈉溶液洗凈積血，立即放入經(jīng)焦碳酸二乙酯 (DEPC)水處理過的凍存管中，置液氮中保存。

1．2．2 逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)檢測垂體腺瘤HIF-1αmRNA的表達 Trizol裂解細胞后提取總RNA，取1μl測光密度 (OD)值，DNA消化。使用日本Toyobo公司試劑盒逆轉錄體系進行cDNA合成。引物 (上海生工生物技術服務有限公司)序列如下:HIF-1α上游:5′-AAA GAC CGT ATG GAA GAC-3′; 下游:5′-CAA AGCGACAGA TAA CAC-3′;β-actin為內參照，上游:5′-CTG TCT GGC GGC ACC ACC AT-3′; 下游:5′-GCA ACT AAG TCA TAC TCC GC-3′。多聚酶鏈式反應 (PCR) 體系:cDNA 2μl，Taq酶0．2μl，總反應體系20μl。PCR循環(huán)條件:95℃預變性3 min;以94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次;72℃延伸7 min，4℃終止反應。1．5%的瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠在Eagle Eye-Ⅱ型圖像分析系統(tǒng)上分析計算。測出HIF-1α擴增帶的OD值，并以β-actin擴增帶的OD值作為參照，得出HIF-1α與β-actin OD值比較的相對比值。

1．2．3 免疫組化檢測垂體腺瘤HIF-1α蛋白的表達 一抗為鼠抗人HIF-1α單克隆抗體，購自加拿大Chemicon公司，鏈霉卵白素—過氧化物酶 (SP)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，免疫組化操作按試劑盒說明進行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，已知陽性組織切片作陽性對照。參照Birner等［2］方法進行半定量分級，高倍鏡下隨機選取5個視野，以陽性細胞率和染色強度的得分之和進行判斷。陽性細胞率＜10%記為陰性，不論其染色深淺，記1分;陽性細胞率11% ～50%記2分，51% ～80%記3分，＞80%記4分。染色強度呈弱染色 (淺黃色)記1分，中等染色 (棕黃色)記2分，強染色 (黃褐色)記3分。上述兩項積分之和為3分者為弱陽性 (+)，4～5分者為中等陽性 (++)，6～7分者為強陽性 (+++)。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以 (±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 侵襲組和非侵襲組垂體腺瘤中HIF-1α蛋白的表達 非侵襲組垂體腺瘤中HIF-1α蛋白表達陽性例數(shù)為9例，陽性率為60．0%(9/15);侵襲組垂體腺瘤中HIF-1α蛋白表達陽性例數(shù)為26例，陽性率為96．3% (26/27)，兩組陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義 (χ2=9．15，P=0．005，見圖 1、表1)。

2．2 侵襲組和非侵襲組垂體腺瘤中HIF-1αmRNA的表達HIF-1αmRNA在侵襲組的表達量為 (0．298±0．094)，在非侵襲組的表達量為 (0．241±0．079)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義 (t=1．041，P=0．329，見圖 2)。

圖1 HIF-1α在垂體腺瘤中的表達 (SP×200)Figure 1 Expression of HIF-1α in pituitary adenomas(SP×200)

表1 兩組垂體腺瘤HIF-1α蛋白表達情況比較 (例)Table 1 Comparison of protein expression of HIF-1αin pituitary adenomas between two groups

圖2 HIF-1αmRNA 在垂體腺瘤中的表達Figure 2 mRNA expression of HIF-1αin pituitary adenomas

2．3 不同大小腫瘤HIF-1α蛋白的表達 根據(jù)影像學測定垂體腺瘤的最大直徑進行比較，垂體腺瘤直徑10～30 mm者HIF-1α蛋白表達陽性例數(shù)為14例，陽性率為70．0%;直徑＞30 mm者HIF-1α蛋白表達陽性例數(shù)為21例，陽性率為95．5%，兩組陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義 (χ2=4．89，P=0．041，見表2)。

表2 不同大小垂體腺瘤標本HIF-1α蛋白表達情況比較 (例)Table 2 Comparison of protein expression of HIF-1αin pituitary adenomas with different diameter

3 討論

垂體腺瘤是顱內常見的實體性腫瘤，絕大多數(shù)組織學上呈良性表現(xiàn)，但常向鞍上和鞍旁海綿竇內生長，甚至突破鞍底骨質，向蝶竇內生長，表現(xiàn)出類似惡性腫瘤侵襲的特征。因此，單純從影像學上難以正確評價垂體腺瘤的生物學行為。

近年來許多研究表明，腫瘤侵襲行為的產(chǎn)生與HIF-1α表達和穩(wěn)定性增加有關，HIF-1α在腫瘤細胞中的表達情況可對腫瘤的惡性程度及侵襲行為的改變進行判斷和預測［3］。

本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在垂體腺瘤中有明顯表達，其表達部位主要位于細胞核，細胞質中也可有少量表達，這與國外的研究結果一致［4］。本研究還發(fā)現(xiàn)，在垂體腺瘤發(fā)生囊變壞死區(qū)域的周邊組織以及腫瘤血管分布稀疏的地方，HIF-1α表達較高。一般認為，距離血管100～200μm以外的區(qū)域即處于缺氧環(huán)境中，大部分腫瘤組織氧分壓低于2．5 mm Hg(1 mm Hg=0．133 kPa)，而正常腦組織則為 24 ～ 66 mm Hg［5］，說明缺氧可能是誘導HIF-1α蛋白表達及穩(wěn)定的重要因素。

Semenza［6］及 Sharp 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對 HIF-1α 蛋白表達的影響體現(xiàn)在轉錄、翻譯和轉錄后等多個過程，其中對轉錄后即在蛋白質水平的調節(jié)是其主要的調控方式。Secades等［8］也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織在缺氧早期即有HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白的增加，并對其下游靶基因的表達進行調控，從而影響腫瘤的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白在侵襲組垂體腺瘤中表達的陽性率高于非侵襲組，而HIF-1αmRNA在侵襲組和非侵襲組垂體腺瘤中表達則無差異，這表明缺氧對垂體腺瘤組織中HIF-1α蛋白表達的影響主要發(fā)生在轉錄后蛋白質水平。

此外，本研究對不同大小垂體腺瘤中HIF-1α蛋白的表達情況也進行了分析，結果顯示，垂體腺瘤直徑＞30 mm者HIF-1α蛋白表達陽性率較高。有研究表明，氧在腫瘤組織中的彌散不超過10個細胞的距離，除此之外，其他部位呈現(xiàn)相對或絕對缺氧狀態(tài)［9］。隨著腫瘤體積的增大，上述情況加重，主要原因可能與腫瘤的微血管數(shù)目相對不足有關。以往研究已經(jīng)證實，垂體腺瘤的微血管密度低于正常垂體組織［10-11］。HIF-1α蛋白在直徑＞30 mm的垂體腺瘤中具有較高程度的表達，這可能與垂體腺瘤中微血管數(shù)目的相對不足所導致的腫瘤組織缺氧有關。

綜上所述，HIF-1α蛋白在侵襲性垂體腺瘤中的表達增加，并且在垂體腺瘤侵襲行為產(chǎn)生的過程中可能發(fā)揮重要的作用。

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7 Sharp FR，Bernaudin M．HIF1 and oxygen sensing in the brain ［J］．Nat Rev Neurosci，2004，5(6):437-448．

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11 潘力雄，劉運生，陳忠平．微血管密度及血管內皮生長因子表達與垂體瘤侵襲性的關系 ［J］．中華神經(jīng)外科雜志，2003，19(4):285-287．