松江鱸MyoD基因cDNA部分片段的序列和表達特征分析

蔡寶平，李風(fēng)鳴，鄭紅梅，楊磊，邵芳，盧祥云，顧志良

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

松江鱸MyoD基因cDNA部分片段的序列和表達特征分析

蔡寶平，李風(fēng)鳴，鄭紅梅，楊磊，邵芳，盧祥云，顧志良

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

生肌決定因子MyoD是生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族的一個重要成員，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要的作用.本實驗通過RT-PCR和3’-RACE等方法，以松江鱸肌肉總RNA為模板，擴增出957 bp的MyoD基因部分序列，包含部分編碼區(qū)長567 bp，編碼翻譯188個氨基酸殘基，3’-UTR區(qū)長390 bp.系統(tǒng)發(fā)育分析表明，松江鱸MyoD與奧尼羅非魚親緣關(guān)系最近.不同組織半定量分析顯示，松江鱸MyoD在各種組織中均有表達，在心臟中表達量最高，預(yù)示著在不同組織中該基因的功能廣泛．

松江鱸；生肌決定因子；3’-RACE；組織表達

動物肌肉的形成是一個復(fù)雜的過程，受包括MRFs家族在內(nèi)的多種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控．MRFs家族由MRF4、MyoG、MyoD和Myf5四個基因組成．該家族基因具有一個保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域（bHLH）[1]．通過該結(jié)構(gòu)域，MRFs可以和E蛋白形成二聚體從而和下游靶基因如肌球蛋白輕鏈、肌酸激酶等基因上游的E-box（CANNTG）結(jié)合而激活該基因表達[2]．研究表明MyoD和Myf5首先在前體節(jié)細胞中表達，在體節(jié)功能的發(fā)揮及成肌細胞的形成中起重要作用，而MyoG和MRF4的表達要相對晚一點，在肌細胞的最終分化中起作用[3]．

MyoD基因是脊椎動物胚胎期肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一，在肌肉特異性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著總開關(guān)的作用．MyoD主要在成肌過程中起作用，MyoD缺失可導(dǎo)致成肌細胞無法進行增殖和分化．MyoD所介導(dǎo)的肌分化機制是研究細胞分化的最佳模型．此外，MyoD基因通過影響MyoG基因的活性來間接影響肌細胞的終端分化過程．MyoD基因首先由Devis等發(fā)現(xiàn)并獲得[4]，此后，對生肌調(diào)節(jié)因子的研究越來越受到人們的重視．迄今已克隆獲得包括人、大鼠、小鼠、爪蟾、斑馬魚、奧尼羅非魚等多種脊椎動物的MyoD基因[5]．

松江鱸（Trachidermus fasciatus）隸屬于鮋形目，杜父魚科，松江鱸魚屬．與黃河鯉、松花江鱖及興凱湖白魚并稱中國四大名魚．其肉質(zhì)鮮美且含有豐富的不飽和脂肪酸及氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用和經(jīng)濟價值．松江鱸是一種降河洄游性、營底棲生活的小型魚類[6]．通常先在海水中孵化，然后再與海相通的淡水河川區(qū)域生長育肥．在我國境內(nèi)，松江鱸主要分布在秦皇島-渤海海區(qū)，鴨綠江-黃海海區(qū)，黃河-黃海海區(qū)，錢塘江-東海海區(qū)[7]．這些地理群體都有固定的天然產(chǎn)卵場．然而近年來因其棲息地遭到不同程度破壞已瀕臨滅絕，1994年被正式列為我國國家二級保護動物．目前對松江鱸的研究主要集中在生態(tài)、生理、胚胎發(fā)育與繁殖習(xí)性等方面[8]，但是對于松江鱸分子生物學(xué)方面的研究很少，且尚未有關(guān)于松江鱸的肌肉生長調(diào)節(jié)因子研究的報道．本實驗克隆和測序松江鱸MyoD基因的3’-端序列．分析了其氨基酸序列在種群間的同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，檢測組織表達特性．為進一步克隆出松江鱸MyoD全長cDNA及深入研究其對肌肉生長發(fā)育的作用機理奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用松江鱸采自蘇州市長江水產(chǎn)繁育工程研究中心．活魚宰殺后取松江鱸肌肉、肝臟、心臟、腎臟、腦、腸6種組織，液氮速凍后于－80℃儲存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 松江鱸總RNA的提取

采用RNAiso（TAKARA，大連）分別提取上述組織的總RNA，用NanoDrop2000（Thermo scientific，USA）測定提取的總RNA的濃度，并用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA質(zhì)量．

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)鯉魚等同源物種MyoD基因序列，用Gene Runner 3.05設(shè)計引物lyMyoD F1/R1和SjlMyoDF2，并用DNAMAN檢驗其保守性．引物由上海生工生物工程有限公司合成．引物3′race outer primer/3′raceinnerprimer為TAKARA 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒所自帶．引物序列見表1．

1.4 RT-PCR、3’RACE

參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進行RT-PCR，反應(yīng)程序為：30℃10 min；42℃30 min；94℃5 min；5℃5 min．以肌肉總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，用引物lyMyoD F1和lyMyoD R1進行PCR擴增．反應(yīng)程序為：94℃變性3 min；94℃30 s；58℃30 s；72℃1 min，35個循環(huán)，72℃10 min．?dāng)U增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳（見圖1），得到350 bp左右的條帶，與預(yù)想結(jié)果接近．經(jīng)膠回收后連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性菌液PCR驗證，由上海生工生物工程有限公司測序，將測序得到的序列在NCBI上進行Blast，確定為松江鱸MyoD基因部分序列．

再以松江鱸肌肉總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得連有3′-RACE Adaptor的cDNA．用引物lyMyoD F1/3′race outer primer進行第一輪PCR擴增，再用引物Sjl MyoD F2/3′race inner primer以第一輪的擴增產(chǎn)物為模板進行巢式PCR．?dāng)U增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到900 bp左右的條帶．同上經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序，確定為松江鱸MyoD基因3’端序列．

1.5 不同組織mRNA表達分析

運用半定量RT-PCR方法檢測不同組織mRNA的表達規(guī)律：反轉(zhuǎn)錄按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0）要求進行（同上述1.3）．RT-PCR時，松江鱸MyoD基因引物lyMyoDF1/R1分別設(shè)計在不同的外顯子上，以β-肌動蛋白基因（β-actin）為內(nèi)參照．PCR擴增條件：95℃變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，25個循環(huán)（β-actin基因）或35個循環(huán)（MyoD基因）；72℃延伸10 min．用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達量．

表1 本研究所用引物

1.6 統(tǒng)計分析及軟件

通過DNAMAN 5.0軟件將上述獲得的兩個片段進行拼接，再用該軟件將所得序列翻譯成氨基酸序列，用DNAMAN軟件和ClustalX1.83軟件與其他物種進行比對，利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹．通過自引導(dǎo)檢驗（bootstrap）獲得系統(tǒng)分支的置信度（重復(fù)次數(shù)為1000）．

2 結(jié)果與分析

2.1 松江鱸MyoD基因部分cDNA和氨基酸序列分析

通過RT-PCR和3′-RACE的方法擴增得到松江鱸MyoD基因部分CDS區(qū)及3-′UTR區(qū)（見圖1，2），克隆測序后拼接得到957 bp的MyoD部分序列（見圖3）．分析表明，該段序列可編碼188個氨基酸殘基，終止密碼子為TAG，3-′UTR區(qū)長390 bp，含有一個AATAAA加尾信號．

圖1 松江鱸MyoD基因中間片段PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖（1號位）

圖2 松江鱸MyoD基因3’-RACE-PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖（2號位）

2.2 松江鱸MyoD基因部分氨基酸片段與其他物種同源性比較

用DNAMAN軟件將得到的MyoD基因的部分序列進行分析，共編碼188個氨基酸殘基（見圖3）．將松江鱸MyoD部分氨基酸片段與其他物種MyoD氨基酸進行比較，發(fā)現(xiàn)其與奧尼羅非魚（Oreochromis aureus）同源性最高，為66.14%．與其他物種同源性分別為：斑馬魚（Danio rerio）61.17%，虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）58.73%，非洲爪蛙（Xenopuslaevis）56.91%，牛（Bos taurus）53.47%，人（Homo Sapi?ens）52.48%，大鼠（Rattus norvegicus）52.74%，小鼠（Mus musculus）51.74%．

2.3 MyoG的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 松江鱸MyoD基因部分cDNA序列及氨基酸序列

利用MEGA 4.1軟件將松江鱸MyoD推斷出的氨基酸序列與人、牛、大鼠、小鼠、斑鱖等16個物種進行比對并構(gòu)建進化樹（見圖4）．結(jié)果顯示，鳥類、哺乳類和魚類分別形成三個大的分支．在魚類中，松江鱸MyoD與奧尼羅非魚的關(guān)系最近，松江鱸MyoD首先與奧尼羅非魚聚集成簇后，又同紅鰭東方鲀聚在一起，說明其與奧尼羅非魚親緣關(guān)系最近，并具有很高的置信度．而與點帶石斑魚（Epinephelus coioides）、斑鱖（Siniper?ca scherzeri）及鱖魚（Siniperca chuatsi）的MyoD距離較遠，說明與它們親緣關(guān)系較遠．

2.4 松江鱸MyoD基因的組織表達分析

采用半定量RT-PCR方法，β-actin作為內(nèi)參照，檢測MyoD基因在松江鱸肌肉、肝臟、心臟、腎臟、腦、腸6種組織中的表達情況（見圖5）．通過PCR優(yōu)化條件分別選擇MyoD基因和β-actin基因在擴增進入平臺期前的循環(huán)數(shù)為35次和25次．結(jié)果表明，在松江鱸各種組織中均檢測到MyoD基因mRNA的表達，在心臟中表達量最高，在其他幾種組織中差異不大．

圖4 不同物種推導(dǎo)的MyoD氨基酸序列構(gòu)建的NJ樹

圖5 松江鱸不同組織MyoD的RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

本實驗克隆了松江鱸cDNA部分序列，共957 bp，編碼188個氨基酸殘基．將該氨基酸序列與小鼠、奧尼羅非魚等8個物種進行比對，發(fā)現(xiàn)同源性較低，為51.74%～66.14%．其中奧尼羅非魚同源性最高，但也僅為66.14%．可能是由于本實驗僅獲得了松江鱸MyoD基因部分序列，而未獲得全長cDNA序列，而此段序列恰恰與其他物種同源性不高．

松江鱸MyoD基因?qū)儆贛RF基因家族的一員，含有一個保守的中央蛋白基序，大小為80個氨基酸，稱為堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH），bHLH高度保守．其中bHLH本身可形成α-螺旋二聚體和四聚體．在MRF分子結(jié)構(gòu)中，bHLH本身可形成α-螺旋二聚體和四聚體，但只有二聚體可與DNA結(jié)合，且二聚體的4個螺旋必須以平行方向排列，每個區(qū)域單獨存在均不能有效地激發(fā)生肌作用[9-10]．堿性區(qū)的Arg111、Ala114、Thr115、Lysl24是激活肌肉基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵，取代掉這些氨基酸，可以使MyoD及其家族基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄作用喪失，但不會影響其與DNA結(jié)合[11]．采用半定量方法進行組織表達分析，在6種組織中均檢測到MyoD基因，在心臟中的表達量尤其高，說明MyoD可能對松江鱸心肌細胞的形成和分化有一定作用．

[1]Rawls A,Valdez M R,Zhang W,et al.Overlapping functions of myogenic bHLH genes MRF4 and MyoD revealed in double mutant mice[J].Development,1998,125(13):2349-2358.

[2]Braun T,Arnold H H.The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties[J].Nucleic Acids Res,1991,19:5645-5651.

[3]Codina M,Bian Y H,Gutierrez J,et al.Cloning and characterization of myogenin from seabream(Sparus aurata)and analysis of promoter muscle specificity[J].Comp Biochem Physiol Part D,2008(3):128-139.

[4]Hans H A,Thomas B.The role of Myf-5 in somitogenesis and the development of skeletal muscles in vertebrates[J].Journal of Cell Science,1993,104:957-960.

[5]于凌云，白俊杰，葉星，等.大口黑鱸MyoD cDNA的克隆和序列分析[J].生物技術(shù)通報，2008，增刊：301-305.

[6]邵炳緒，唐子英，孫幗莢，等.松江鱸魚繁殖習(xí)性的調(diào)查研究[J].水產(chǎn)學(xué)報，1980，4（1）：8l-88.

[7]潘連德，蔡飛，馬召騰，等.中國境內(nèi)松江鱸魚的種群特征以及資源保護[J].水產(chǎn)科技情報，2010，37（5）：211-214.

[8]王金秋，潘連德，梁天紅，等.松江鱸魚（Trachidermus fasciatus）胚胎發(fā)育的初步觀察[J].復(fù)旦大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，43（2）：250-254.

[9]嚴婷婷，邵芳，王野，等.赤眼鱒Myf5基因的克隆、序列和表達分析[J].常熟理工學(xué)院學(xué)報，2011，25（8）：71-75.

[10]蘇艷紅，王瑞元，周越.運動與生肌調(diào)節(jié)因子研究進展[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（6）：770-773.

[11]王立新，白俊杰，葉星，等.草魚MyoD cDNA的克隆和序列分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（10）：2134-2138.

Identification and Characterization of Partial cDNA Sequence of MyoD Gene in Trachidermus fasciatus

CAI Bao-ping,LI Feng-ming,ZHENG Hong-mei,YANG Lei,SHAO Fang,LU Xiang-yun,GU Zhi-liang
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Myogenic determination gene is an important member of the myogenic regulation factors(MRF)family, which plays an important role in the specific gene transcription.A 957 bp long MyoD cDNA sequence in Trachider?mus fasciatus was obtained by using RT-PCR and 3′-RACE method,which included a 390 bp 3′-UTR,and par?tial ORF 567bp encoding 188 amino acid peptide.MyoG gene expression was detected in all six examined tissues, and highly expressed in heart.It suggested that the MyoD gene might contribute to a wide range of biological func?tions.

Trachidermus fasciatus;MyoD;3′-RACE;tissue expressional pattern

S917. 4；Q38

A

1008-2794（2012）04-0052-05

2012-03-09

2011年江蘇省大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目“松江鱸肌肉調(diào)節(jié)因子基因克隆和表達特征研究”；常熟市科技項目“松江鱸種質(zhì)資源的保存和優(yōu)質(zhì)基因的發(fā)掘利用”（CN201111）

蔡寶平（1989—），女，江蘇新沂人，2009級生物工程專業(yè)學(xué)生．

顧志良（1968—），男，江蘇常熟人，教授，博士，研究方向：動物分子遺傳學(xué)，E-mail:zhilianggu88@hotmail.com.