印記基因?qū)μケP發(fā)育的影響

尹秋丹，張林波，田見暉*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物制藥創(chuàng)新實驗室，吉林 長春130118;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京100193)

印記基因是一類具有父母雙方來源的等位基因，但是只表達(dá)其中一方的遺傳信息，而另一方處于沉默狀態(tài)的基因。其中父源表達(dá)、母源沉默的基因稱為母源印記基因，反之則稱為父源印記基因。在哺乳動物基因組中，印記基因成串出現(xiàn)在富含CpG 核苷酸的DNA 序列簇中，這些特殊的區(qū)域，稱為印記控制區(qū)域［1］。目前，哺乳類動物基因組中大約存在100 ～200 個印記基因，在鼠類和人類基因組中已確定的約80 種。印記基因?qū)τ谔旱纳L發(fā)育與行為，特別是胎盤的發(fā)育都極其重要，印記基因的異常表達(dá)會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生［2］。

胎盤是懷孕期間形成的第一個器官，雖然短暫，卻對胎兒發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，例如胎兒的新陳代謝和營養(yǎng)控制、氣體和代謝物的交換以及控制內(nèi)分泌。一個功能正常的胎盤是哺乳動物存活與生長的重要保障之一［3］。胎盤是印記基因活動最重要的器官之一，盡管胎盤的形成顯示出不同物種間的差異，但是在真亞綱哺乳動物中，尤其是靈長類、嚙齒類和反芻動物中的基因印記活動是保守的。

印記作用被認(rèn)為是在胚胎發(fā)育時期母體營養(yǎng)資源分配過程中，父源基因組和母源基因組沖突假說理論的應(yīng)答變體。沖突假說，即父源表達(dá)基因促進(jìn)胎盤發(fā)育并為胎兒提供更多營養(yǎng)，促進(jìn)胎兒迅速生長，以期獲得強壯個體; 母源表達(dá)基因則是為了自己的終身繁殖能力，限制胎兒生長速度和體重，節(jié)省和平均各胎次的繁殖資源［4］。胎盤是胎兒生長所需營養(yǎng)的主要資源，印記基因通過調(diào)節(jié)胎盤發(fā)育和營養(yǎng)物的轉(zhuǎn)運，就可以影響母體-胎兒資源分配和胎盤對周圍環(huán)境改變的應(yīng)激反應(yīng)，以及及時變更子宮內(nèi)養(yǎng)分有效性。同時這些作用影響子宮內(nèi)組織的發(fā)育編程，并與成人以后的一些疾病的發(fā)病率息息相關(guān)［5］。因此，印記基因通過調(diào)節(jié)胎盤生長發(fā)育，從而影響胎兒發(fā)育，具有十分重要的作用。

1 印記基因的表觀調(diào)控方式

印記基因的“印記”機(jī)理是印記一方的基因調(diào)控序列DNA(一般認(rèn)為是啟動子) 被甲基化和組蛋白被甲基化，其中DNA 甲基化是關(guān)鍵［6］。DNA 甲基化是已知最早被發(fā)現(xiàn)的與基因抑制相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制。在哺乳動物中，它發(fā)生于CpG 二核苷酸。甲基化DNA 在基因組上的分布表明它們集中出現(xiàn)在非編碼區(qū)和散在的重復(fù)元件區(qū)域，是在DNA甲基化酶作用下，將S- 腺苷酞甲硫氨酸(SAM) 分子上的甲基轉(zhuǎn)移到DNA 分子中胞嘧啶殘基的5 位碳原子上。胞嘧啶被甲基化為5-甲基胞苷。此時該等位基因?qū)⒈魂P(guān)閉，不再表達(dá)。另一方等位基因的調(diào)控序列未被甲基化等修飾，在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體作用下可以正常進(jìn)行mRNA 轉(zhuǎn)錄。在哺乳動物生命周期中，性原細(xì)胞階段，DNA 分子甲基化被清除。配子階段，重新建立DNA 甲基化。對于非印記基因，隨后出現(xiàn)去甲基化，在受精后父源基因組DNA 去甲基化過程是主動的，母源基因去甲基化過程是被動的［7］?；蛴∮泤^(qū)域甲基化DNA 的存在導(dǎo)致胎盤類哺乳動物中母源或父源等位基因的沉默，包括X染色體失活。這表明在進(jìn)化過程中它們獨有的利用這一表觀遺傳機(jī)制來穩(wěn)定沉默［8］。許多印記基因和印記調(diào)控子鄰近的序列存在有差異甲基化序列和DNA 甲基化修飾，DNA甲基化在基因組印記的維持中所充當(dāng)?shù)闹匾巧谶z傳學(xué)中得到了證明。

2 印記基因與胎盤發(fā)育

印記基因在胎盤中廣泛卻又短暫的表達(dá)，但其作用對于正常胎盤發(fā)育是必需的。在嚙齒類動物中，當(dāng)印記基因甲基化的建立受損，這包括與其相關(guān)基因的異常表達(dá)和甲基化抑制劑的作用，都會使胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化及凋亡發(fā)生異常，從而導(dǎo)致胎盤的異常發(fā)育而使其不能正常發(fā)揮功能。在老鼠中，通過選擇性基因敲除手段而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因突變個體中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有異常的胎盤發(fā)育，這包括異常的胎盤重量、迷路滋養(yǎng)層以及成膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育異常(表1)［1］。在正常受孕的人類嬰兒中，異常的胎盤重量經(jīng)常伴隨著混亂的印記基因表達(dá)出現(xiàn)，而且有報道稱，在發(fā)育遲緩或早產(chǎn)嬰兒中胎盤內(nèi)常伴有印記基因表達(dá)異常。并且各基因在胎盤發(fā)育的不同時期有不同表達(dá)量，不是所有基因在胎盤形成初始至胎兒出生都有表達(dá)［9］。

一般來講，胎盤的正常發(fā)育需要父源印記基因和母源印記基因共同調(diào)控，通過父源基因的表達(dá)快速發(fā)育，通過母源基因的表達(dá)受到發(fā)育限制，任何一方的基因表達(dá)異常都會導(dǎo)致胎盤發(fā)育異常。這已通過對敲除基因突變體各項檢測得到論證，這也與沖突假說理論表述一致。例如，H19-IGF2基因位點父源表達(dá)的IGF2基因編碼生長因子IGF2，促進(jìn)胎盤生長發(fā)育; 而母源表達(dá)的IGF2r 和H19 基因會直接或間接限制IGF2的表達(dá)，從而抑制胎盤發(fā)育，減少胎盤重量(表1)［10］。類似的，Phlda2 基因敲除的小鼠胎盤的重量高于平均重量，而敲除RTL1 基因的小鼠則表現(xiàn)為胎盤生長發(fā)育遲緩。還有一些基因，例如PEG10 和Mash2，如果敲除這些基因不僅會影響血性絨毛膜胎盤的形成，甚至?xí)?dǎo)致懷孕中期胚胎致死率的增高［11］。

在很多敲除型突變個體中，胎盤重量上的改變還常伴隨著形態(tài)學(xué)上的變化，從而直接影響胎盤對胎兒營養(yǎng)的供應(yīng)。例如老鼠胎盤，分為3 個區(qū)域: 含有肝糖原細(xì)胞的底蛻膜區(qū)域，成膠質(zhì)細(xì)胞的分界區(qū)域以及包含了3 層滋養(yǎng)層細(xì)胞層的迷路區(qū)域。其中成膠質(zhì)細(xì)胞具有內(nèi)分泌作用，而滋養(yǎng)層細(xì)胞則是母體-胎兒進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)闹匾獏^(qū)域。當(dāng)通過敲除特異印記基因使其表達(dá)異常時，這3 個區(qū)域的發(fā)育則會發(fā)生異常。尤其是迷路區(qū)域的面積，肝糖原的數(shù)目和基因位點以及在厚度和器官膜上的變化，這些都將成為母體和胎兒之間物質(zhì)循環(huán)的障礙［12，13］。這些變化同樣會改變一些哺乳動物胎盤的表面積和滋養(yǎng)層中的多血管系統(tǒng)，使成膠質(zhì)細(xì)胞不能正常發(fā)育，妨礙胎盤絨毛膜形成［14］。而且交界處總面積的變化和細(xì)胞成分上的變化都可以通過母體新陳代謝和對胎兒的營養(yǎng)物質(zhì)分配直接影響胎兒生長發(fā)育，使胎盤的糖原利用和激素生成產(chǎn)生差異，嚴(yán)重影響胎盤正常發(fā)育與功能［15，16］。

表1 在小鼠懷孕晚期，印記基因?qū)μ?胎盤生長及胎盤形態(tài)學(xué)的作用［1］

3 印記基因與胎盤營養(yǎng)物質(zhì)的運輸

測量營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運是通過檢測在敲除印記基因或印記基因過表達(dá)的突變型個體中，胎盤所轉(zhuǎn)運物質(zhì)的量。與野生型相比，IGF2PO(父源IGF2) 胎盤會轉(zhuǎn)運更多的MeAIB(α-甲氨基異丁酸)［17］，它同樣轉(zhuǎn)運更多的鈣和甲基-D-葡萄糖［18］。在大多數(shù)情況下，這些營養(yǎng)物質(zhì)運輸上的改變伴隨著胎盤上特異葡萄糖和A 系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的改變［17］。Sla38a4，父源印記基因，A系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運子亞型，在IGF2完全失效胎盤通過這種基因的減少效應(yīng)和MeAIB 轉(zhuǎn)運蛋白的正向調(diào)節(jié)，使X 和Y 氨基酸轉(zhuǎn)運子系統(tǒng)豐裕度減少，這也解釋了為何這些突變體宮內(nèi)發(fā)育遲緩［17］。這些發(fā)現(xiàn)表明，印記基因在調(diào)節(jié)胎盤上營養(yǎng)物轉(zhuǎn)運過程中扮演著重要角色。

通常情況下，胎盤厚度上的改變會影響被動擴(kuò)散性質(zhì)，而胎盤的通透性則是被動擴(kuò)散的標(biāo)記，同時滋養(yǎng)層表面積的變化會影響通過簡單擴(kuò)散和轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的營養(yǎng)物的運輸過程［19］。例如，在基因表達(dá)有缺陷的突變體膜上的甘露糖、EDTA(乙二胺四乙酸) 和菊糖含量減少，導(dǎo)致胎盤或脈管系統(tǒng)的表面積減少，影響物質(zhì)運輸［20，21］。綜上，胎盤內(nèi)印記基因的正常表達(dá)以及它們之間的互作對胎盤正常生長發(fā)育、生理功能和營養(yǎng)物質(zhì)運輸都是至關(guān)重要的。

4 印記基因作為環(huán)境誘發(fā)表觀修飾信號

除了調(diào)節(jié)胎盤生長發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運之外，胎盤內(nèi)的印記基因可以迅速感應(yīng)環(huán)境變化進(jìn)而變更胎盤表型。研究表明，印記基因調(diào)控在胎盤環(huán)境微干擾中比胚胎或胎兒組織中表現(xiàn)更為敏感，尤其在胚胎植入前改變早期胚胎環(huán)境在決定以后胎盤內(nèi)印記基因表達(dá)模式中顯得尤為重要［22］。而這些發(fā)現(xiàn)與利用體外輔助生殖技術(shù)獲得人類嬰兒的胎盤中印記基因表達(dá)混亂的結(jié)果一致［23］。

環(huán)境誘發(fā)改變的印記基因表達(dá)與胎盤生長和營養(yǎng)物質(zhì)運輸能力改變有關(guān)。對比IGF2PO 和IGF2無效突變體表明，印記基因可以同樣對胎兒所需營養(yǎng)做出迅速感應(yīng)［24，25］。當(dāng)IGF2只在迷路區(qū)域中缺乏時，胎盤變得更加高效，并且可以提高營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的豐富性，通過其它表達(dá)IGF2的胎兒組織幫助維護(hù)其生長［26］。當(dāng)所有胎兒組織中IGF2的表達(dá)均缺乏時，胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白豐富度降低，胎兒相關(guān)生長率降低［24］。當(dāng)胎盤對胎兒正常營養(yǎng)物質(zhì)的需要和供給不匹配時，IGF2PO 正向表達(dá)會增加MeAIB 運輸和Slc38a2 氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，這樣胎盤會對胎兒生長供給更多，進(jìn)而可在懷孕后期保證胎兒正常生長率。同樣，在Phlda2 過表達(dá)的胎盤中，相似的營養(yǎng)供求機(jī)制也可以促進(jìn)正向調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)表達(dá)和離子轉(zhuǎn)運蛋白，以保證胎兒生長發(fā)育。反過來，在懷孕后期孕體過生長時，胎盤減少的被動通透性和MeAIB 的運輸可能反射母源信號，抑制胎盤營養(yǎng)物的支配來調(diào)節(jié)胎兒生長［20］。由此可見，胎兒和胎盤間印記基因的相互影響不僅與調(diào)節(jié)營養(yǎng)物分配有關(guān)，同樣可以應(yīng)答環(huán)境信號。

5 輔助生殖技術(shù)(ARTs)和體細(xì)胞克隆(NT)引起的胎盤印記異常

ARTs 是近年來迅速發(fā)展并已廣泛應(yīng)用于人類和動物，用以嘗試校正生育能力損傷的技術(shù)，可以提高特殊物種生殖效率，包括體外受精、ICSI 等。雖然它的應(yīng)用廣泛，但是這項技術(shù)的使用和體外培養(yǎng)條件會對胚胎造成損傷，因此具有很高的胚胎死亡率。在實驗動物中，大多數(shù)胚胎由于異常甲基化不能重編程，無法正常發(fā)育為胚胎。同時它增加了胎盤異常形態(tài)的發(fā)病率。這都與印記基因異常表達(dá)相關(guān)。

動物體細(xì)胞克隆是應(yīng)用顯微操作技術(shù)將體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞中，再將重構(gòu)胚移入體內(nèi)培養(yǎng)，以期成為正常個體。該技術(shù)中的去分化和恢復(fù)全能性是成功的關(guān)鍵。雖然已經(jīng)有多種動物通過克隆產(chǎn)生個體，但是克隆動物的存活率低，且存在大量表型異常及不同程度缺陷一直是克隆技術(shù)中存在的重要問題［27］。主要表現(xiàn)為克隆動物胚胎和胎盤的過度生長。而這正與許多印記基因表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致的癥狀相似。體細(xì)胞克隆時，供體細(xì)胞不適當(dāng)?shù)谋碛^遺傳重編程，如DNA 甲基化，可能是導(dǎo)致體細(xì)胞克隆效率低的原因［28］。有證據(jù)表明，重編程過程中，一些印記基因會被破壞，導(dǎo)致基因組印記缺陷。而核移植操作和體外培養(yǎng)對卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞造成的損傷及發(fā)育異常也會被帶到重構(gòu)胚中，致使印記基因表達(dá)異常［29］。例如，在體外培養(yǎng)液中加入血清會干擾DMR 的甲基化和IGF2r 的表達(dá)［30］。而基于印記基因?qū)τ谔ケP正常發(fā)育和生理功能的重要作用，在克隆動物中，胎盤及胎兒發(fā)育的異常也就不足為怪。因此這也是導(dǎo)致克隆效率低的一個重要因素。

6 結(jié)論與展望

不同基因在多樣的表觀遺傳修飾調(diào)控下開啟或關(guān)閉，執(zhí)行各自的功能?；蚪M印記就是通過甲基化作用等方式實現(xiàn)對來源于不同親本的等位基因表達(dá)的調(diào)控，從而保證各基因的正常表達(dá)。胎盤作為對胎兒生長有決定性作用的器官，有許多特異印記基因的表達(dá)，這些基因表達(dá)調(diào)控胎盤的正常發(fā)育及結(jié)構(gòu)形成，同時對于胎盤的主動運輸能力和轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)有極其重要的作用。這也關(guān)系到母體-胎兒之間物質(zhì)循環(huán)，充足的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運是保證胎兒發(fā)育的首要因素之一。同時，這些基因可以感應(yīng)周圍環(huán)境的微小變化并迅速作出反應(yīng)，平衡母體和胎兒的營養(yǎng)供求。一旦這些基因出現(xiàn)表達(dá)上的異常，則會引起胎盤表型上的異常，導(dǎo)致其功能出現(xiàn)異常。因此這些印記基因的正常表達(dá)以及協(xié)同作用是保證胎盤的生長發(fā)育以及行使其生理功能的重要因素。

回顧哺乳動物發(fā)育中的幾種重要的基因印記作用，確定印記基因在功能健全和胎兒發(fā)育中的重要作用?；蛴∮涀饔玫墨@得和進(jìn)化是基礎(chǔ)生物學(xué)問題之一，不斷探索各基因的功能、表達(dá)機(jī)制以及基因間的互作將成為這一問題研究的必要環(huán)節(jié)。而且這些印記基因也將成為一些遺傳類疾病的治療靶點，并且可以應(yīng)用在體外輔助生殖技術(shù)中用以改良人類生育及動物繁殖中的一些問題。因此，研究胎盤內(nèi)印記基因的表達(dá)和作用具有重大意義。

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