質(zhì)譜技術(shù)在氨基酸分析方法中的應(yīng)用

熊 霞， 楊煥勝， 印遇龍

（中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙，410125）

氨基酸不僅是蛋白質(zhì)的組成單位，也是參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞信號分子。此外，氨基酸還是腸道主要能量來源和合成神經(jīng)遞質(zhì)、多胺和NO的前體物質(zhì)[1-3]。氨基酸作為代謝過程的重要靶標(biāo)，它們的定量分析對于疾病診斷以及闡明不同營養(yǎng)狀況對機(jī)體生理機(jī)能的影響非常重要。氨基酸分析方法就是測定含游離氨基酸，多肽或蛋白質(zhì)樣品中氨基酸含量的方法。目前，氨基酸分析在氨基酸代謝系統(tǒng)疾病的臨床診斷、生物醫(yī)藥研究、生物工程、食品科學(xué)等領(lǐng)域中有著廣泛而重要的應(yīng)用[4]。

目前存在的氨基酸分析方法有柱前衍生-離子交換色譜[5-8]、氣相色譜[9-12]、液相色譜[13-14]和毛細(xì)管電泳[15-16]等。在過去幾十年中，氨基酸分析主要是通過柱前衍生-離子交換色譜和鄰苯二甲醛（OPA）與氯甲酸芴甲酯（FMOC）柱前衍生-液相色譜分離，光度檢測法檢測完成的。柱前衍生-離子交換色譜法重復(fù)性高，但分析時間長，耗費(fèi)高。柱前衍生液相色譜法靈敏快速，但對分析物的特異性不強(qiáng)。而且這兩種方法都不能區(qū)分14N和15N標(biāo)記氨基酸，不能進(jìn)行同位素標(biāo)記定量。隨著現(xiàn)代氨基酸分析技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜作為高選擇性和高靈敏度的檢測工具，在氨基酸分析中發(fā)揮著重要作用。作者就近30年來國內(nèi)外液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（GE-MS）技術(shù)在氨基酸分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述并對目前存在的主要氨基酸分析技術(shù)進(jìn)行了比較。

1 氨基酸分析中的色譜或電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

1.1 樣品制備

根據(jù)不同的樣品特性通常采取不同的預(yù)處理以保證氨基酸分析的準(zhǔn)確[18-19]，如對不同狀態(tài)（液體或固體）、食品或生物樣品采取的預(yù)處理方式不同。如果是分析生物樣品中的游離氨基酸首先需要去掉其中的蛋白質(zhì)，通常采用的去蛋白試劑為磺基水楊酸、三氯乙酸或高氯酸去蛋白然后超濾。如果樣品中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%以上的脂肪，則可能需要在水解前對樣品進(jìn)行脫脂，特別是對分析樣品中色氨酸來說這點(diǎn)更是重要。而蛋白質(zhì)或多肽中的氨基酸分析首先需要把蛋白質(zhì)或多肽水解成氨基酸后再進(jìn)行分析，水解方法包括酸水解、堿水解、酶水解和微波水解，具體方法詳見相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]。此外，根據(jù)分離儀器的不同，需要不同的樣品的預(yù)處理，如反相高效液相色譜（RP-HPLC）和GC分離前需要進(jìn)行氨基酸衍生。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

在20世紀(jì)70年代，GC-MS開始應(yīng)用于氨基酸分析。GC-MS是用來分析揮發(fā)性或半揮發(fā)性小分子化合物的重要分析方法，對難揮發(fā)和高分子質(zhì)量的代謝物的檢測效果不太好。GC法用來分析氨基酸前需要對氨基酸進(jìn)行衍生，目前主要的氨基酸衍生方法包括硅烷化、烷基化和?；痆10]。其中硅烷化是主要的衍生方法，它主要是通過N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙?；˙STFA）[11]和 N-（特丁基二甲基硅烷）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）[12]在干燥的條件下加熱或酯化/?；瓿傻腫20]。但并不是所有的硅烷化后的氨基酸衍生物都穩(wěn)定，如精氨酸衍生物會裂解為鳥氨酸以及谷氨酸，谷氨酸會轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼?。而且，衍生過程樣品中水分的存在會嚴(yán)重影響衍生產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[21]。雖然硅烷化是使用最廣泛的方法，但它存在單一分析物對應(yīng)多個副產(chǎn)物的缺點(diǎn)。為了克服這些缺點(diǎn)，研究者們用氯甲酸酯間接烷基化或?；苌鶾22]。氨基酸與氯甲酸酯進(jìn)行的間接烷基化反應(yīng)能直接在液相中反應(yīng)而不必事先除去蛋白質(zhì)。氨基酸的?；王セ苌峭ㄟ^酐/醇如五氟丙酸酐和異丙醇，或在乙醇和吡啶存在的條件下與氯甲酸酯反應(yīng)形成烷基化完成的[23-24]。氨基酸與衍生試劑的反應(yīng)非常迅速，衍生物通過有機(jī)酸萃取并直接進(jìn)到質(zhì)譜儀檢測[11，25-27]。

GC-MS分析方法靈敏度高，分辨率和重復(fù)好，主要用于疾病、植物等氨基酸定量分析及氨基酸對映異構(gòu)體鑒定中[28-30]。Duncan等人采用同位素稀釋氣相色譜離子捕獲負(fù)電離質(zhì)譜鑒定了樣品中微量成分準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)[11]。Deng等通過固相微萃取和GC-MS快速測定了新生兒血液樣本氨基酸[24]。結(jié)果顯示該方法是篩查新生兒苯丙酮尿癥和楓糖尿癥的強(qiáng)大工具。Kaspar等人直接通過氯甲酸丙酯衍生生理體液中的游離氨基酸，用GC-MS全自動完成了整個分析過程，30 min內(nèi)測定了30種氨基酸，并用19種穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸作為內(nèi)標(biāo)以校正生理體液在樣品制備，衍生不完全和電離效率過程中氨基酸的損失，其檢測和定量范圍在0.03～12 μmol/L 和 0.3～30 μmol/L[3]。 Chen 等通過固相離子交換色譜分離了植物樣品中的氨基酸再衍生并通過GCMS鑒定，在30 min內(nèi)鑒定了19種氨基酸。結(jié)果證明該法有效，特別是對氨基酸的同位素分布檢測，而且樣品制備簡便，快速，經(jīng)濟(jì)，易于自動化，適合于大量樣品的分析[31]。而且GC/MS在分析氨基酸的對映異構(gòu)體上有特殊的作用[30]。此外，二維氣相色譜（GC Χ GC）-TOF-MS已成為代謝組學(xué)研究領(lǐng)域的新興技術(shù)[28]。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

柱前衍生-液相色譜-光學(xué)檢測法是氨基酸分析中應(yīng)用廣泛的一種方法，其中使用到的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛 （OPA）、二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-cl）、2，4-二硝基氟苯（FDNB）、異硫氰酸苯酯（PITC）、異硫氰酸熒光素（FITC）、氯甲酸酯類和氨基苯甲酸酯類等[4，32]。該法重復(fù)性好和靈敏度高，但特異性不強(qiáng)。由于復(fù)雜生物樣品中一些非蛋白氨基酸或化合物跟氨基酸有相似的保留時間，從而造成了分析的不確定性。此外，光學(xué)檢測方法也不適合于分析含同位素樣品。而質(zhì)譜能區(qū)分共洗脫復(fù)合物，除非它們等壓或有相同的破碎模式。而在過去的十年中，HPLC-MS-MS由于它高特異性分析，對大分子和小分子化合物的廣泛適用性，高度的靈活能力等優(yōu)點(diǎn)在多個研究領(lǐng)域被應(yīng)用如臨床診斷等[33]。目前用于氨基酸分析的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)包括離子對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（IP-LC-MS/MS）、穩(wěn)定同位素標(biāo)記相對或絕對定量/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（iTRAQ-LC-MS-MS）和親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HILIC-MS）等。

IP-LC-MS/MS能通過反相C18柱分離未衍生的氨基酸，揮發(fā)性的IP試劑如全氟羧酸能在液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS）中使用。Piraud等人通過IP-HPLC-MS在20分鐘內(nèi)用十三氟庚酸測定了76種氨基酸，有16種氨基酸通過它們的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物內(nèi)標(biāo)得到定量[34]。Armstrong等通過IP-RP-HPLC/偶聯(lián)時間飛行質(zhì)譜（TOF-MS）定量了人血液中25種未衍生氨基酸，線性動態(tài)范圍在1.56-400umolL-1[35]。Harder等通過 IP-LC-MS鑒定了血漿中22種氨基酸，包括蛋白氨基酸、瓜氨酸和鳥氨酸[36]。

相對和絕對定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）技術(shù)是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)[37]。分析物與反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)后帶上一個等量異位標(biāo)簽。該標(biāo)簽中含有的報(bào)告基團(tuán)在二級質(zhì)譜中碰撞誘導(dǎo)解離并被檢測。由于報(bào)告基團(tuán)相對分子質(zhì)量相差1，因此不同報(bào)告基團(tuán)離子強(qiáng)度的差異就能進(jìn)行氨基酸的定量。iTRAQ-LC-MS-MS的最大優(yōu)勢在于能讓每種分析物都有一個內(nèi)標(biāo)，但對含硫氨基酸如蛋氨酸和半胱氨酸定量則沒那么精確。尿液氨基酸分析通常是通過茚三酮與紫外檢測器柱后衍生陽離子交換層析完成的，但這種方法缺乏高通量和特異性。目前對尿液氨基酸的分析方法有CE-TOF-MS，13C 核磁共振譜（NMR），GE-MS 和同位素稀釋LC-MS/MS。Kaspar等比較了GC-MS和iTRAQ-LC-MS法和氨基酸分析儀對尿液氨基酸的分析。研究表明，GC-MS和iTRAQ-LC-MS/MS都適合高通量的氨基酸分析，但GC-MS重復(fù)率更高以及樣品前處理能達(dá)到全自動，而iTRAQ-LC-MS/MS靈敏度更高[38]。李鵬飛等人通過iTRAQ-LC-MS-MS定量分析了人體中42種氨基酸。與傳統(tǒng)的CE、HPLC和氨基酸分析儀相比，無論是精度還是檢測限和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度都有了很大的提高[39]。

HILIC采用親水的極性固定相，如硅膠填充柱、極性聚合物填料或離子交換吸附劑，結(jié)合反相型的溶液體系分離極性物質(zhì)。它作為一種分離極性化合物的液相色譜模式，應(yīng)用的研究領(lǐng)域有藥物分析、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等。HILIC流動相組成簡單、分離效率高，與質(zhì)譜兼容。Schlichtherle-Cernv等通過HILIC-ESI-MS檢測了食品中小分子量的極性物質(zhì)，如氨基酸、二肽或三肽和有機(jī)酸等[40]。Langrock等通過聚酰胺柱結(jié)合ESI-MS-MS在中性丟失掃描模式下25 min內(nèi)分離了16種蛋白氨基酸（PAA）[41]。

1.4 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法

毛細(xì)管電泳是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種分離技術(shù)，毛細(xì)管電泳分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測方法為氨基酸及其對映異構(gòu)體分析提供了低成本，高分辨率和高靈敏度的顯微分離平臺[42-43]。毛細(xì)管電泳進(jìn)行氨基酸分析不需要衍生，但氨基酸衍生后檢測靈敏度能提到提高。大部分適用于HPLC的衍生試劑也適用于毛細(xì)管電泳方法，如FMOC、NDA、OPA和FITC[44]。而且GE中的樣品富集和化學(xué)衍生很容易在線整合，不要復(fù)雜的離線樣品處理步驟，所以很容易實(shí)現(xiàn)自動化。但CE分離后通過光度法或電化學(xué)檢測方法檢測復(fù)雜樣品進(jìn)行精確而可靠的定量還是稍顯欠缺。

CE-ESI-MS是以少量的樣品處理鑒定復(fù)雜生物樣品中氨基酸譜的高選擇性，靈敏而可靠的方法。氨基酸及其類似衍生物的質(zhì)譜分析一般是在強(qiáng)酸性的條件下正離子模式檢測，隨著在線樣品富集，化學(xué)衍生，ESI接口設(shè)計(jì)的新進(jìn)展，氨基酸異構(gòu)體分辨率和低濃度的不穩(wěn)定氨基硫醇檢測限得到進(jìn)一步提高。Soga等通過毛細(xì)管電泳電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（CE-ESI-QqQ-MS）分析了尿液中未衍生游離氨基酸，這種方法的檢測限（LOD）值在0.1～14 μmol/L，線性動態(tài)范圍大約 100～200 μmol/L[45-46]。 該方法具有分析時間短，靈敏度高以及幾乎沒有基質(zhì)干擾的優(yōu)點(diǎn)。Wakayama等同時分析出了34種胺類物質(zhì)和氨基酸，陽離子模式和陰離子模式下的檢測限分別為 2.5 μmol/L 和 5 μmol/L[47]。 氨基酸的羧基丁基化后能提高離子化效率和檢測靈敏度。Sanchez-Hernandez等把植物油中提取的氨基酸殘基（鳥氨酸、丙氨酸、）在80℃與丁醇反應(yīng)30 min，酸性條件遷移（0.1 mol/L甲酸緩沖液和未涂層彈性石英毛細(xì)管柱）和ESI-MS-MS檢測。它們 的LOD值分別為0.04和0.19 ng/g[48]。而且通過對分析物在CE遷移行為的精確預(yù)測和MS提供的精準(zhǔn)的質(zhì)量等信息能促進(jìn)新的氨基酸或肽類似物的鑒定[49，50]。

近年來毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（CE-MS）在氨基酸分析中得到廣泛使用，包括食品安全、植物生理、臨床診斷研究[45，51]。為了辨別橄欖油中是否摻入種子油，Sanchez-Hernandez等通過基于離子阱質(zhì)量分析器的CE-MS鑒定到了6種丁醇衍生后的非蛋白氨基酸（鳥氨酸、β-丙氨酸、GABA、別異亮氨酸、瓜氨酸和焦谷氨酸），其中鳥氨酸和別異亮氨酸是種子油而非橄欖油中的[48]。水稻是研究最多的農(nóng)作物之一，基于CE-MS的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的水稻細(xì)胞其代謝的動態(tài)變化主要受到胞內(nèi)氨基酸的累積影響[52]。Williams等人通過GC-MS和CEMS檢測了植物細(xì)胞培養(yǎng)液中氨基酸的變化[53]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CE-ESI-MS與GC-MS相比鑒定了覆蓋了更多種類的氨基酸，花費(fèi)小而且樣品處理相對簡單。

2 其它氨基酸分析檢測方法及其氨基酸分析方法間的比較

直接注入式串聯(lián)質(zhì)譜（Direct-infusion MS-MS）一般用來篩查具有先天性代謝缺陷的新生兒血液和尿液中的氨基酸變化如苯丙酮尿癥。血液或尿液樣品一般都是通過濾紙收集。將濾紙中的氨基酸用含穩(wěn)定同位素氨基酸甲醇提取，然后在丁醇中與鹽酸反應(yīng)生成相應(yīng)的丁酯[54]。這個方法能分析大量的樣品，但對亮氨酸和異亮氨酸等同分異構(gòu)氨基酸不同區(qū)分。而NMR的主要優(yōu)點(diǎn)是能同時檢測出樣品中所有含氫代謝物，重復(fù)性好而且定量結(jié)果可靠；能直接分析生理體液如尿液，其靈敏度不受分析物化學(xué)特性的限制。其主要的缺點(diǎn)在于與質(zhì)譜相比靈敏度要差，對樣品的要求較高。

3 結(jié)語

氨基酸分析作為代謝組學(xué)的重要研究內(nèi)容，其研究和改進(jìn)一直受到人們的重視，如何減少樣品制備和分析時間，進(jìn)一步提高分析過程的分辨率、靈敏度和重復(fù)性等一直是氨基酸分析方法中的研究重點(diǎn)。由于質(zhì)譜具有高度靈敏性和選擇性，以及在穩(wěn)定同位素標(biāo)記中的重要作用，為更快、更準(zhǔn)確的定量氨基酸提供了基礎(chǔ)。

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