副豬嗜血桿菌病的研究現(xiàn)狀

姜寶奎 劉宴博 （山東省萊陽市畜牧獸醫(yī)局 265200）

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副豬嗜血桿菌病的研究現(xiàn)狀

姜寶奎 劉宴博 （山東省萊陽市畜牧獸醫(yī)局 265200）

隨著豬場規(guī)模化、集約化程度的不斷提高，豬群飼養(yǎng)密度越來越大，呼吸道疾病逐漸成為繼繁殖障礙性疾病、胃腸道疾病之后危害養(yǎng)豬業(yè)的三大癥候群之一。特別是近年來，豬“高熱性”呼吸道疾病的蔓延和遷延不愈，尤其是副豬嗜血桿菌(，Hps)引起的以豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、呼吸困難、高熱及高死亡率為特征的傳染性疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細菌性疾病，我國20 世紀90 年代才開始對該菌進行研究，而且主要集中在細菌分離鑒定、血清學(xué)鑒定、藥物敏感性試驗和臨床防治研究等方面。本文就副豬嗜血桿菌的病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機理、菌株的分離鑒定及診斷和防制措施等方面的研究進展進行了綜述。

1 病原學(xué)

早在1910年，德國科學(xué)家Glsser就發(fā)現(xiàn)了副豬嗜血與豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎之間的聯(lián)系，最早Hjarre和Wramby將病原體稱為豬嗜血桿菌()，而Leece將病原體稱為豬流感嗜血桿菌()。在證明了該菌生長時不需要X因子(血紅素和其它卟啉類物質(zhì))的基礎(chǔ)上，該菌更名為副豬嗜血桿菌[2]。Hps是一種多形態(tài)、非溶血性、不運動、NAD依賴型、革蘭氏陰性細小桿菌，兼性厭氧。具多種不同形態(tài)的細菌，從單個球桿狀到長的、細長的以至絲狀菌體，?？梢娗v膜。其在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48 h生長較差，為光滑型、灰白色透明、直徑大約0.5mm菌落。如與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)時，HPS在葡萄球菌條狀菌苔附近呈衛(wèi)星生長，生長良好，菌落直徑可達1～2 mm。HPS在血液瓊脂上呈小而透明的不溶血菌落，在加NAD、馬血清的M96支原體培養(yǎng)基或加NAD、馬血清和酵母浸出物的PPLO培養(yǎng)基上生長良好。生化反應(yīng)為尿酶試驗陰性、氧化酶陰性、接觸酶試驗陽性，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麥芽糖等。

Ruiz A等研究表明，外膜蛋白(OMP)與Hps的毒力有關(guān)，從健康仔豬與患病豬分離的Hps OMP不同，有多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎癥狀的豬分離的Hps OMP基本相同。OMP蛋白質(zhì)共有8種，大小分別約為9.2萬，8.8萬，5.3萬，6.0萬，4.6萬，3.7萬，3.1萬及1.5萬Da[3]。Charland等證明豬血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的存在，并分析兩種轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(transferrin bindingprotein, Tbp)的多肽結(jié)構(gòu)。TbpA和TbpB能夠特異的捕獲宿主的轉(zhuǎn)鐵蛋白，并將鐵轉(zhuǎn)運到細胞漿中，以提供細菌生長所需。Tbp在Hps感染宿主動物以引起發(fā)病起到?jīng)Q定性作用[4]。Lichtensteiger等指出，一種神經(jīng)氨酸酶與細菌的宿主細胞內(nèi)生長活性有關(guān)。該酶存在于細菌對數(shù)生長末期，提供細菌保持活力的非離子態(tài)鈣，他們隨后在Hps的分泌液中提純了這種有潛在毒力的神經(jīng)氨酸酶，這進一步推動了Hps致病因子的研究[5]。

2 流行病學(xué)

引起豬傳染性胸膜肺炎的病原菌有3 種，即胸膜肺炎放線桿菌(AP)、豬嗜血桿菌(Hs) 和副豬嗜血桿菌(Hps)。副豬嗜血桿菌自1910年以來就作為病原菌而被認為是豬Glasser病的病原體。然而，直到90 年代才對其發(fā)病和防制進行了深入研究。由副豬嗜血桿菌引起的急性型疾病早期癥狀包括發(fā)熱、食欲不振和厭食，也可見到呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、運動不協(xié)調(diào)、發(fā)紺、不愿活動以及死亡[6]。耐過急性發(fā)病的豬表現(xiàn)為被毛粗亂、咳嗽、呼吸困難和生長遲滯。有人報道了副豬嗜血桿菌引起的非典型癥狀，如猝死(通常由敗血性休克所致) 和非特異性呼吸道癥狀(呼吸困難、咳嗽) 和生長遲滯。急性型疾病的特征性病變是漿液性--纖維蛋白性多發(fā)性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。近年來，還從細菌性肺炎、化膿性支氣管肺炎病變中分離到副豬嗜血桿菌，而且通常將此菌看作是繼發(fā)性病原菌。在豬繁殖與呼吸綜合征、II型豬圓環(huán)病毒所致疾病(斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征)、偽狂犬病及豬流感等感染之后，這類菌分離的頻率，甚至從漿液性--纖維蛋白性多發(fā)性漿膜炎病例中的分離頻率一直都在增高。按Kieletein-Rapp-Gabrielson(KRG)血清分型方法，目前副豬嗜血桿菌至少可分為 15 個血清型[7]，其中在德國 4、5 型最為流行[7]，在澳大利亞 5 型、13 型最為流行[8]，在美國5型最為流行[9]。同時，20%以上的分離株不能分型[10]。在我國，副豬嗜血桿菌在各豬場引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮，已從北京、山東、黑龍江、遼寧、河南、湖南、寧夏、湖北等省市分離出副豬嗜血桿菌。

除了KRG血清分型方法之外，研究者也嘗試用整個細菌體裂解產(chǎn)物進行SDS- PAGE 電泳，對副豬嗜血桿菌進行分型，結(jié)果除KRG血清型1型為SDS -PAGE III型外，其它血清型，如5型、6型、10型均屬SDS- PAGE I型。HPS只感染豬，可以影響從2周齡到4月齡的豬，主要在斷奶前后和保育舍階段發(fā)病通常見于5～8周齡，發(fā)病率可達40%，嚴重時死亡率可達50%。通?？蓮慕】地i的鼻腔分泌液中分離出病菌，還可以從患肺炎豬的肺臟中分離出來。在分離的15 種血清型菌株中，1、5、10、12、13、14型毒力最強，患豬歸于死亡或處于瀕死狀態(tài)；2、4、8、15型為中等毒力，患豬死亡率低，但出現(xiàn)敗血癥狀，生長遲滯；3、6、7、9和11型毒力較低，患豬沒有明顯的臨床癥狀。

3 致病機理

呼吸道中的HPS可引起上呼吸道黏膜表面纖毛活動顯著降低，損傷纖毛上皮，引起膿性鼻炎；病灶處由于纖毛丟失，鼻黏膜和支氣管黏膜急性腫脹，黏膜損傷，從而增加細菌入侵機會。有研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等能降低豬肺泡巨噬細胞的吞噬和殺菌能力，從而增加了Hps的感染機率。Hps的一種可溶性毒素可能與所觀察到的細胞病變有關(guān)[10]。Lichtensteiger等的研究表明，90%以上的現(xiàn)場分離菌株都產(chǎn)生神經(jīng)氨酸苷酶(唾液酸酶)，這種酶與透酶和醛縮酶協(xié)同作用，通過奪取宿主細胞的碳水化合物而增強細菌毒力。除了對營養(yǎng)方面的影響以外，神經(jīng)氨酸苷酶還介導(dǎo)清除與宿主細胞糖原結(jié)合的唾液酸，從而暴露出細菌定居或侵入宿主細胞所需的受體，并通過降低黏蛋白的黏性從而干擾宿主的防御系統(tǒng)[5]。

另外，很多學(xué)者們認為，Glasser 病流行病學(xué)的改變在一定程度上是因為副豬嗜血桿菌在幼豬體內(nèi)的定居模式所致，而這些定居模式則受到管理方法(比如隔離或早期斷奶)的影響。這些觀點可以歸納為：（1）仔豬可在不同時間被母豬排出的Hps所定居，定居時間取決于母豬的免疫力水平和母豬的細菌排出水平；（2）在一定的日齡，斷奶豬中只有一定比例的個體被Hps定居，這一比例可隨斷奶日齡的增大而增加；（3）斷奶時被Hps定居仔豬的比例較低時，則在保育舍內(nèi)細菌從定居仔豬向非定居仔豬的傳播會很慢；（4）在母源免疫力消失后受到感染的仔豬會發(fā)病。

4 分離與鑒定

在一般條件下，HPS難于分離和培養(yǎng)，尤其是應(yīng)用抗生素治療過的病豬病料，給本病的診斷帶來了許多困難。因此，對于許多獸醫(yī)來說，從臨床樣品中分離HPS仍是一個挑戰(zhàn)。雖然用PCR可以檢出臨床樣品中的HPS，但是，要通過血清分型與基因分型對分離物進一步定性，還必須進行分離。許多因素都可能會影響到HPS的分離，包括選擇采樣的動物和在樣品提交給診斷實驗室之前對樣品的處理。研究表明，采取以下措施可以提高從臨床樣品中分離HPS的機會。

4.1 采樣動物的選擇 很少能從死豬中分離出HPS。為了提高分離的機會，應(yīng)當對表現(xiàn)急性感染臨床癥狀的未治療豬進行無痛處死并采樣。雖然最好選擇表現(xiàn)有呼吸窘迫(腹式呼吸、咳嗽)和關(guān)節(jié)腫脹的豬采樣，但是，對表現(xiàn)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的豬也可以考慮，重要的是要從慢性病變中區(qū)分急性病變。在保育期暴發(fā)中存活的豬可能在肥育初期發(fā)生臨床癥狀。這些臨床癥狀可能與胸，腹腔發(fā)生纖維化有關(guān)。一般不能從慢性感染豬分離出HPS。

4.2 采樣部位的選擇 HPS是上呼吸道中一種共棲微生物。由于可以從健康動物的鼻腔、扁桃體、氣管中分離出HPS。因此，分離HPS的理想部位是腦(腦膜)、心包、胸膜、腹膜和關(guān)節(jié)。在觀察到纖維蛋白性胸膜炎時可以提交肺組織。在某些情況下，HPS只引起肺炎。從肺炎肺回收到分離物可能表示或不能表示侵襲豬群的“問題”菌株。雖然HPS可以引起敗血癥，并且可以表明在血液中發(fā)生急性感染，但是，并不常使用從現(xiàn)場病例采集的血液樣品進行分離。

4.3 采樣方法的選擇 可以用無菌拭子采集供分離HPS用的樣品，并將拭子置于含有Stuart或Amies培養(yǎng)基的運送系統(tǒng)中呈送。Amies系統(tǒng)保持HPS的活力比Stuart系統(tǒng)更好。應(yīng)當用拭子采集器官表面上的纖維蛋白滲出物樣品。免疫組織化學(xué)研究表明，在纖維蛋白滲出物中通常含有豐富的HPS細胞?？梢杂脽o菌注射器采集關(guān)節(jié)、腹膜、心包以及胸腔中的液體。HPS在組織中比在拭子中存活時間長。由于在同一頭豬的不同部位可能分離出不同的HPS株，所以提供的組織樣品應(yīng)當單獨包裝呈送?？梢詮幕顒游锊蓸佣鵁o須進行無痛處死。例如可以用無菌注射器和針頭從腫脹關(guān)節(jié)采集滑液。采樣后樣品應(yīng)當立即冷凍。

4.4 供分離用樣品的呈送 HPS對溫度敏感。在42℃下的生理鹽水中1h、37℃下2h及25℃下8h HPS即不能檢出。但在冷藏溫度(4℃)下，HPS可以存活較長時間。采集供分離HPS的樣品應(yīng)當盡可能快的呈送診斷實驗室(1～2d)。拭子、組織樣品或含有體液的注射器應(yīng)當用冰鎮(zhèn)容器呈送。組織應(yīng)當新鮮呈送，不要使用福爾馬林保存。

5 診斷和防制措施

首先，可以根據(jù)臨床癥狀進行初步診斷。其臨床癥狀為：豬病早期病象包括被毛粗亂、精神沉郁、發(fā)熱(40.5~42.0℃)、厭食，也可見到呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、運動不協(xié)調(diào)、皮膚紫斑。病豬經(jīng)常起臥，長聲尖叫，顫抖，共濟失調(diào)，可視黏膜發(fā)紺，跛行。一個或幾個關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)熱和疼痛，多見于腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)。許多病例出現(xiàn)腦膜炎癥狀。耐過急性發(fā)病的豬可以痊愈，但受害嚴重者會留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)，公豬慢性跛行。

確診必須進行實驗室檢查。由于在死亡病例較難分離到HPS，一般應(yīng)選取典型病例人工處死。同時應(yīng)注意的是，僅從鼻腔、扁桃體或氣管等組織臟器中分離細菌，對于評估是否由HPS引起的致病是沒有意義的，應(yīng)從全身多個部位如心包、關(guān)節(jié)、心血、腦脊液等處進行病原分離。目前，用于HPS診斷的血清學(xué)方法有：瓊脂擴散試驗、補體結(jié)合試驗、間接血凝試驗等[2]。由于在一個豬群中，出現(xiàn)HPS的幾種菌株或幾種血清型毒株同時感染的現(xiàn)象比較普遍，甚至在個別病例，不同標本內(nèi)可發(fā)現(xiàn)不同菌株或血清型感染，各血清HPS之間存在交叉反應(yīng)，因此診斷意義不大。國內(nèi)和國際上現(xiàn)都已開發(fā)出HPS的PCR診斷方法，可用于HPS的快速診斷，具有很高的靈敏度。

事實證明，副豬嗜血桿菌病的防治治僅使用抗生素來預(yù)防和治療，效果往往得不償失，要徹底解決豬場的副豬嗜血桿菌病問題，還必須依靠有效的疫苗。接種疫苗是控制HPS病的有效方法之一。如果將在豬群中引起發(fā)病的 HPS菌株應(yīng)用在菌苗之中(商品苗或自家苗)，則可能成功地產(chǎn)生保護。讓豬接觸無致病力的 HPS菌株，也可誘發(fā)其對有毒菌株的抵抗力。已有報道能成功地使用商業(yè)化或自家菌苗預(yù)防和治療本病，但也有一些菌苗缺乏效力的事例，這可能是因為病程中出現(xiàn)菌株的血清型不同而缺乏交叉保護力。由于菌株致病力的差異，以及當前對保護性抗原和毒性因子缺乏深刻的認識，還不可能有一種滅活疫苗同時對豬所有的致病菌株產(chǎn)生交叉免疫力。因此，在應(yīng)用疫苗免疫的基礎(chǔ)上，應(yīng)加強對感染豬群中所有豬的抗生素治療。同時，對HPS繼發(fā)感染性疾病，要加強對原發(fā)病的控制和治療，加大養(yǎng)豬場生物安全管理，減少或消除其它呼吸道病原物。此外，Takahashi 等通過臨床和實驗室研究表明，HPS血清2型和5型制備的二價疫苗比單價疫苗更能有效地保護豬群，可防止HPS病的暴發(fā)，二次免疫后保護期可達79d，這進一步證明各血清型間交叉保護力低，多價苗的免疫效果比單價苗的更好。因此，多價苗的研制將是 HPS疫苗今后的一個發(fā)展方向。

防治方案包括抗生素治療和免疫接種，同時還要配合以優(yōu)良的管理措施，以減少或消除其它呼吸道病原。加強飼養(yǎng)管理，減少各種環(huán)境應(yīng)激，增強豬的抵抗力，加強隔離消毒，實行統(tǒng)一日齡斷奶以及嚴格的全進全出制，杜絕將各生產(chǎn)階段的豬或不同來源的豬混群飼養(yǎng)等。

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（2012–06–15）

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