藥物遞呈載體對(duì)提高CpG-DNA免疫刺激活性的作用

范 媛，謝光武，黎曉敏

（1.重慶市萬(wàn)州動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶 404000；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715）

免疫佐劑CpG-DNA的發(fā)現(xiàn)源于早期人們對(duì)癌癥治療的探究。研究已證實(shí)，CpG-DNA作為多種抗原的佐劑，表現(xiàn)出獨(dú)特的免疫增強(qiáng)作用，其可以刺激機(jī)體對(duì)免疫原產(chǎn)生較早、較強(qiáng)、較持久的免疫應(yīng)答。此外，CpG-DNA經(jīng)鼻腔、口腔、直腸等途徑免疫接種后，具有明顯的黏膜佐劑的效應(yīng)；而作為新型疫苗的佐劑，其能夠克服新型疫苗中PAMP不足的缺陷，通過(guò)模擬感染過(guò)程誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[1]。然而，CpG-DNA的體內(nèi)清除和有效遞呈卻在很大程度上限制了其免疫學(xué)應(yīng)用。特別是APCs細(xì)胞對(duì)CpG-DNA的結(jié)合與攝取是誘發(fā)免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)，而由于受到CpG-DNA半衰期較短和體內(nèi)核酸酶降解的限制，往往使CpG-DNA在以一定免疫途徑進(jìn)入機(jī)體后，很快便被核酸酶降解吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，細(xì)胞的有效攝取率根本無(wú)法達(dá)到閾值水平，從而降低了CpG-DNA免疫刺激活性。因此，藥物載體遞呈技術(shù)的應(yīng)用，不僅能夠解決體內(nèi)降解的問(wèn)題，而且還能有效提高CpG-DNA的免疫刺激活性。這對(duì)于有效增強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)、降低刺激性、較快產(chǎn)生抗體以及刺激細(xì)胞免疫具有重要意義。

1 納米載體

遞呈載體納米化處理使得納米粒具有無(wú)免疫原性、細(xì)胞毒性；有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，可獲得靶基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)；可保護(hù)藥物或靶基因不受機(jī)體血漿或組織細(xì)胞中多種酶類(lèi)和補(bǔ)體的破壞。武梅等對(duì)納米粒徑的PLG和脂質(zhì)體作為包裝分子包裹含CpG序列的pUC18質(zhì)粒對(duì)豬副傷寒疫苗的免疫增效進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，其免疫增強(qiáng)效果同脂質(zhì)體包裹后的免疫佐劑效應(yīng)相似或更強(qiáng)[2]。向一等采用殼聚糖納米粒包裹CpG-DNA聯(lián)合重組乙肝疫苗具有增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫應(yīng)答能力[3]。彭蓉等也成功地采用殼聚糖納米顆粒（CNP）包裹CpG ODN，并發(fā)現(xiàn)CpG-DNA具有高效誘導(dǎo)小鼠對(duì)乙肝疫苗的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，減少佐劑用量[4]。Joseph等以納米粒脂質(zhì)體包裹CpG-DNA，也可以誘導(dǎo)機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，且共度試驗(yàn)中能夠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力[5]。由于納米載體包裹，CpG-DNA在機(jī)體內(nèi)可以誘導(dǎo)高水平的SIgA表達(dá)，可以作為很好的黏膜免疫佐劑[6-7]。這些都提示納米載體的應(yīng)用有利于CpG-DNA的有效遞呈，從而全面增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。

2 脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物

脂質(zhì)體作為遞呈載體是臨床應(yīng)用較早且發(fā)展最為成熟的一類(lèi)新型靶向制劑，具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、可生物降解等特點(diǎn)。脂質(zhì)體及其脂質(zhì)體復(fù)合物作為DNA載體，可以有效提高免疫佐劑CpGDNA的生物活性，增強(qiáng)APCs的吞噬效應(yīng)，提高其抗原提呈效率和能力；延長(zhǎng)體內(nèi)停留時(shí)間，形成倉(cāng)庫(kù)效應(yīng)；減少佐劑、疫苗使用量、降低毒副作用等[8-9]。Jaafari等采用水合脫水法將CpG-DNA和利什曼原蟲(chóng)抗原（rgp63）包裹于脂質(zhì)體中，并免疫BALB/c小鼠，攻毒試驗(yàn)表明，脂質(zhì)體包裹組能夠產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)力，提高IgG2a/IgG1和誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IFN-g[10]。Wilson等人用脂質(zhì)體納米包裹CpG ODN后不同途徑免疫ICR小鼠后觀察其免疫增效作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體不僅能夠顯著提高APCs對(duì)CpG-DNA的吞噬，節(jié)約佐劑用量，提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫；同時(shí)，其藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，包裹后的CpG-DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布具有很高的靶向性，且與免疫的途徑具有一定的相關(guān)性[11]。孫瑞林等在探討多聚胺膽固醇陽(yáng)離子脂質(zhì)體（PCL）與CpG-DNA復(fù)合物對(duì)哮喘小鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的影響中發(fā)現(xiàn)，PCL霧化介導(dǎo)可以減輕以EOS為特征的炎癥反應(yīng)，利用PCL為轉(zhuǎn)染載體包裹CpG-DNA，可提高轉(zhuǎn)染效率[12]。

3 藻酸鹽微粒

藻酸鹽是一種生物可降解材料，在特定條件或自然條件下能夠被化學(xué)試劑、微生物或酶降解的材料，其具有良好的生物相容性，且降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生毒副作用。當(dāng)其作為免疫佐劑CpG-DNA的載體運(yùn)送入機(jī)體，可有效避免核酸酶降解，促進(jìn)抗原和佐劑的共遞呈，并且通過(guò)聚合物的降解緩慢釋放包裹的抗原，減少給藥次數(shù)，獲得長(zhǎng)期的免疫效果，更能有效地經(jīng)胞吞作用進(jìn)入到鼻相關(guān)淋巴組織（MALT），誘導(dǎo)機(jī)體的黏膜免疫應(yīng)答，可以成為很好的黏膜疫苗制劑。Ferreiro等利用藻酸鹽和多聚賴(lài)氨酸制成的嵌段聚合物作為CpG-DNA的載體，可以保護(hù)CpG-DNA在機(jī)體內(nèi)不被降解，提高CpG-DNA的穩(wěn)定性，從而保證其免疫刺激活性的正常發(fā)揮[13]。Tafaghodi等利用藻酸鹽包封破傷風(fēng)內(nèi)毒素（TT）和CpG-DNA兩種物質(zhì)通過(guò)鼻免疫患白化病的兔子進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包封后組血清中IgG水平顯著高于其他組別且人體試驗(yàn)結(jié)果表明，包封能夠避免紅細(xì)胞溶血和鼻刺激黏液物的產(chǎn)生[14]。有報(bào)道指出，利用藻酸鹽-殼聚糖載體系統(tǒng)包裹CpG-DNA和肝炎細(xì)胞B表面抗原免疫機(jī)體后，免疫協(xié)同CpG-DNA的免疫刺激活性，誘導(dǎo)高水平IFN-g和偏Th1型的抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)；同時(shí)，緩控釋抗原-佐劑復(fù)合物的釋放和遞呈[15]。

4 陽(yáng)離子高聚物

陽(yáng)離子高聚物通過(guò)電荷相互作用與帶負(fù)電的CpG-DNA分子形成聚電解質(zhì)復(fù)合體，復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞，然后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。這些陽(yáng)離子高聚物內(nèi)的氨基在生理pH下會(huì)發(fā)生質(zhì)子化。質(zhì)子化的氨基可以中和CpG-DNA質(zhì)粒表面的負(fù)電荷，使DNA分子壓縮為體積相對(duì)較小的粒子結(jié)構(gòu)，從而使DNA免受核酸酶的降解。陽(yáng)離子高分子載體種類(lèi)很多，以殼聚糖為代表的天然陽(yáng)離子是一種非常具有應(yīng)用潛力的非病毒類(lèi)基因載體，有良好的生物相容性和可降解性，其結(jié)構(gòu)中的游離氨基在酸性條件下可結(jié)合氫離子形成帶正電的多聚物，可與帶負(fù)電的DNA分子形成復(fù)合物，在體內(nèi)保護(hù)DNA免受核酸酶降解，充分利用CpG-DNA的免疫活性，增強(qiáng)免疫應(yīng)答效應(yīng)。呂學(xué)斌等制備了聚乙交酯丙交酯（PLG）納米顆粒，比較了陽(yáng)離子PLG納米顆粒和脂質(zhì)體作為載體包裹CpG分子對(duì)小鼠體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子PLG納米顆粒包裹后顯著提高免疫小鼠總IgG，小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量明顯增加，淋巴細(xì)胞增殖活性及IL-2的誘生活性增強(qiáng)；同陽(yáng)離子脂質(zhì)體的效應(yīng)相似或較強(qiáng)，能顯著提高裸CpG質(zhì)粒的免疫增強(qiáng)活性[16]。陳曉琦等采用含編碼呼吸道合胞病毒（RSV）抗原質(zhì)粒DNA的脫乙酰殼多糖DNA納球，試驗(yàn)證明其能夠有效預(yù)防急性RSV的感染[17]。Xie等采用聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）載體吸附CpG-DNA聯(lián)合鋁制炭疽苗免疫機(jī)體后發(fā)現(xiàn)，與CpG-DNA和疫苗混合組、疫苗組相比，加入PLGA免疫組的免疫應(yīng)答水平顯著高于其他兩組，且具有很好免疫保護(hù)作用[18]。祁智等應(yīng)用殼聚糖（CS）包載 CpG-DNA，制備 CS-CpG-DNA基因載體，不僅提高了CpG-DNA對(duì)裂解酶的穩(wěn)定性；同時(shí)，由于殼聚糖的天然免疫活性，協(xié)同增強(qiáng)了CpG-DNA的免疫作用能力，產(chǎn)生了更強(qiáng)更持久的免疫應(yīng)答[19]。另外，溴化十六烷基三甲基胺（CTAB）、溴化十六烷基二甲基乙基銨（CDAB）、雙十二烷基二甲基溴化銨（DDAB）、多聚-L-賴(lài)氨酸（PLL）、聚乙烯亞胺（PEI）等化學(xué)合成試劑也是很好的陽(yáng)離子遞呈載體材料。其作為CpG-DNA和抗原的遞呈載體，同樣能夠有效提高CpG-DNA的佐劑效應(yīng)，同時(shí)兼具靶向、緩釋、長(zhǎng)效的作用特點(diǎn)。

5 小結(jié)

理想的載體應(yīng)具備靶向特異性，并且可被免疫系統(tǒng)識(shí)別；藥物釋放可控緩釋性，能在導(dǎo)入部位形成“抗原貯存庫(kù)”效應(yīng)；高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化；無(wú)毒性，對(duì)病人及環(huán)境安全無(wú)害；具有免疫協(xié)同效應(yīng)。目前，我國(guó)關(guān)于免疫佐劑CpG-DNA遞呈載體的研究還處于起步階段，尚存在許多空白和需完善的地方。此外，CpGDNA的安全問(wèn)題仍然是一個(gè)不能忽視的問(wèn)題。所以，今后應(yīng)著眼于載體、佐劑、抗原三者之間的配比，最適宜的免疫途徑以及載體材料的選擇對(duì)免疫刺激的影響等多方向研究。力求從藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)、免疫學(xué)等理論的多角度進(jìn)行多分析。相信隨著CpG-DNA作用機(jī)制的不斷清晰，CpGDNA遞呈載體的研究不斷完善和發(fā)展，開(kāi)發(fā)出更適合CpG-DNA臨床應(yīng)用的載體系統(tǒng)，使其在消滅和控制傳染病、寄生蟲(chóng)病以及自身免疫性疾病中便能發(fā)揮極為重要的作用，顯示出極強(qiáng)的使用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

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