人miR-205真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

吳義高，肖 戈，徐文清，黃 福，胡衛(wèi)列，王 尉

(1南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣州510515;2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科研究所)

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，miR-205參與了細胞的增殖、分化、凋亡及侵襲等，與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)中miR-205低表達。但miR-205在ACC中的作用機制尚不清楚，且目前國內(nèi)外鮮見miR-205與ACC關(guān)系的報道。ACC惡性程度高，侵襲性強，約40%在診斷時已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，其早期診斷與腎上腺良性腫瘤鑒別困難，其治療仍以根治手術(shù)為主，缺乏有效的藥物治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差［2］。2011年9月～2012年5月我們通過構(gòu)建miR-205真核表達載體，轉(zhuǎn)染SW-13細胞后使其獲得miR-205的穩(wěn)定高表達，從而為miR-205靶點驗證和功能研究提供強有力的實驗基礎(chǔ)，為ACC臨床診療提供一種可能的新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 ACC細胞SW-13購自上海細胞所; pcDNA3.1(+)為南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存; E.coli DH5α感受態(tài)細胞、Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司;G418、LATaq聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTPMixture、HindⅢ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA marker、膠回收試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix均為TaKaRa公司產(chǎn)品;基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;IL-15培養(yǎng)基及胎牛血清均由廣州威佳公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計與合成 miRbase數(shù)據(jù)庫中獲得miR-205前體pre-miR-205的序列(AAAGATCCTCAGACAATCCATGTGCTTCTCTTGTCCTTCATTCC ACCGGAGTCTGTCTCATACCCAACCAGATTTCAGTG GAGTGAAGTTCAGGAGGCATGGAGCTGACA)，在premiR-205的頸環(huán)序列上下游各延伸200 bp左右設(shè)計引物調(diào)取pre-miR-205基因組序列，并在引物上引入末端的保護堿基、HindⅢ、XhoⅠ的酶切位點，引物由上海生工生物公司合成。引物序列為:miR-205 HindⅢ F:5'-CCC AAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC-3';miR-205 XhoⅠR:5'-CCGCTCGAGGA AGCACGCACACTCCAGATG-3'。

1.2.2 miR-205真核表達載體pcDNA3.1(+)-miR-205的構(gòu)建與鑒定 按DNA抽提試劑盒說明書提取腎上腺皮質(zhì)細胞SW-13基因組DNA，用預(yù)先設(shè)計引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94℃5 min預(yù)變性，94℃ 20 s，55℃20 s，72℃ 35 s經(jīng)過30個循環(huán)，再72℃擴增5 min后于16℃保存;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收獲得目的產(chǎn)物。將回收的目的產(chǎn)物用HindⅢ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，獲得目的基因片段。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后回收線性化空載體。取2 μL回收的線性化空載體與3 μL的目的基因片段，在T4 DNA Ligase作用下，16℃連接2 h;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞后，均勻涂于含氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取純化試劑盒進行質(zhì)粒提取，取3 mL提取質(zhì)粒在37℃下HindⅢ、XhoⅠ酶切2 h，酶切產(chǎn)物在含1%瓊脂糖凝膠電泳分離，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像;最后將酶切鑒定正確的克隆送華大基因公司測序，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提測序正確克隆的質(zhì)粒，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SW-13細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-miR-205和穩(wěn)定克隆的篩選 轉(zhuǎn)染前1 d對SW-13細胞株進行傳代，使其匯合度為60%～70%，轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000試劑，轉(zhuǎn)染時使用Opti-MEM培養(yǎng)基。實驗共分3組:①pcDNA3.1(+)空載體組;②pcDNA3.1(+)-miR-205重組質(zhì)粒組;③未轉(zhuǎn)染組。每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染使用24孔板，每孔加入1 μg質(zhì)粒，稀釋到400 μL Opti-MEM培養(yǎng)基為A液，取2 μL Lipofectamine 2000溶解于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基為B液，B液混合5 min后，A液和B液混合，靜止20 min后加到細胞培養(yǎng)板中，以上操作是每孔用量。孵育4 h后換為10%FBS的IL-15完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，換為含G418(200 mg/L)的10% FBS的IL-15完全培養(yǎng)基，每3 d換1次液，2周后未轉(zhuǎn)染組SW-13細胞全部死亡，轉(zhuǎn)染組仍有細胞存活，繼續(xù)按上述方法壓力篩3周后，獲得穩(wěn)定細胞系，擴大培養(yǎng)。

1.2.4 RT-qPCR驗證SW-13細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-miR-205的表達情況 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-miR-205細胞組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)細胞組及未轉(zhuǎn)染組分別進行培養(yǎng)，提取總RNA，純度檢測:OD260/ OD280的比值大于1.8，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄形成得第一鏈cDNA為模板，由實時定量熒光miRNA特異引物進行 PCR反應(yīng)，使用 SYBR Green PCR Master Mix，反應(yīng)條件:95℃變性15 s，65℃退火15 s，72℃熒光檢測32 s，重復(fù)40個循環(huán)。60～95℃繪制溶解曲線，每個樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)以U6為內(nèi)參照，其引物為:U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6-R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'; miR-205引物序列為:pre-miR-205 F:5'-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCCACCGGAG-3'，pre-miR-205 R:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增基因組DNA中miR-205片段 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在553 bp處可見一特異擴增條帶，擴增條帶在Marker 500 bp和750 bp之間，產(chǎn)物的大小與NCBI數(shù)據(jù)庫檢索的miR-205大小一致，證明miR-205目的基因已擴增出來(封二圖3)。

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-205的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-205經(jīng)HindⅢ、XhoⅠ雙酶切后，可見一大一小兩條擴增帶，其中在553 bp的位置出現(xiàn)目的條帶(封二圖4)，說明篩到的克隆為陽性克隆，送質(zhì)粒去測序。

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-205的測序鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-205經(jīng)酶切分析為正確的克隆，基因測序生物公司的測序結(jié)果與miRbase中的序列一致。Sequence 0、Sequence 1分別為pre-miR-205、pcDNA3.1(+)-miR-205序列，經(jīng)Megalign比對軟件證實了構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確(封二圖5)。

2.4 RT-qPCR檢測miR-205的表達差異 pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，兩者miR-205的表達無明顯差異，而pcDNA3.1(+)-miR-205轉(zhuǎn)染組與 pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組相比，pcDNA3.1 (+)-miR-205轉(zhuǎn)染組miR-205的表達升高約32倍(P＜0.01)，表明重組表達載體 pcDNA3.1(+)-miR-205能夠在SW-13細胞中高水平表達miR-205。

3 討論

在不同種屬中，miR-205都是一種高度保守的miRNA。在保護小鼠及紅鰭東水鲀基因序列的基礎(chǔ)上，miR-205通過計算機方法首次被預(yù)測出來［3］，隨后miR-205的表達在斑馬魚及人類體內(nèi)得到確認［4，5］。miR-205基因定位于 1號染色體 LOC 642587位點第二內(nèi)含子上。miR-205在斑馬魚上皮表達［6］，在人類乳腺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤細胞中明顯低表達［7］。

研究miRNA功能較為直接的是利用遺傳學(xué)方法。早先的miRNA及功能都是通過正向遺傳學(xué)方法鑒定的，即利用突變表形尋找遺傳位點，再克隆基因［8］。反向遺傳學(xué)則是通過從已知miRNA出發(fā)，通過異常表達產(chǎn)生的表型，從而獲知miRNA功能。利用反向遺傳學(xué)方法，人們發(fā)現(xiàn)miR-181促進骨髓造血肝細胞B細胞分化［9］，miR-375調(diào)控胰島素分泌［10］。反向遺傳學(xué)的核心是過表達技術(shù)，構(gòu)建miRNA真核表達載體是一種較常用過表達技術(shù)，其miRNA能發(fā)揮更持久的作用。構(gòu)建miRNA真核表達載體的方法有:①利用統(tǒng)一表達框的miRNA過表達技術(shù)［11］;②利用人類基因組DNA為模板，擴增出miRNA的前體序列后克隆到真核表達載體［12］，構(gòu)建成能夠過表達miRNA的真核重組載體。構(gòu)建miRNA的真核表達載體能較好地模擬體內(nèi)miRNA的自然表達過程，能夠更真實地體現(xiàn)miRNA的生物學(xué)功能。

本研究我們采用的真核表達載體pcDNA3.1 (+)，該載體含CMV啟動子，Amp、Neo抗性基因及polyA加尾信號等，并且能夠在大多數(shù)哺乳動物細胞中穩(wěn)定表達［13］。我們將重組質(zhì)粒 pcDNA3.1 (+)-miR-205轉(zhuǎn)染到SW-13細胞，細胞培養(yǎng)過程中始終維持G418篩選壓力，獲得質(zhì)粒整合進基因組DNA的單克隆細胞。為了檢測重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-miR-205在篩選獲得的SW-13細胞中是否能夠穩(wěn)定表達miR-205，我們通過RT-qPCR技術(shù)進行檢測，結(jié)果顯示miR-205在SW-13細胞內(nèi)較高水平表達，說明重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-miR-205在SW-13細胞系中篩選成功。這為進一步研究miR-205在腫瘤細胞的生長、凋亡、侵襲浸潤所起的作用提供研究基礎(chǔ)，為ACC的診療提供一種可能的新的方法。

［1］Carrington JC，Ambros V.Role of microRNAs in plant and animal development［J］.Science，2003，301(5631):336-338.

［2］Soon PS，McDonald KL，Robinson BG，et al.Molecular markers and the pathogenesis of adrenocortical cancer［J］.Oncologist，2008，13(5):548-561.

［3］Lim LP，Glasner ME，Yekta S，et al.Vertebrate microRNA genes［J］.Science，2003，299(5612):1540.

［4］Wienholds E，Kloosterman WP，Miska E，et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonic development［J］.Science，2005，309 (5732):310-311.

［5］Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing［J］.Cell，2007，129(7):1401-1414.

［6］Ason B，Darnell DK，Wittbrodt B，et al.Differences in vertebrate microRNA expression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 (39):14385-14389.

［7］Shingara J，Keiger K，Shelton J，et al.An optimized isolation and labeling platform for accurate microRNA expression profiling［J］.RNA，2005，11(9):1461-1470.

［8］Iwai N，Naraba H.Polymorphisms in human pre-miRNAs［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，331(4):1439-1444.

［9］Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation［J］.Science，2004，303(5654):83-86.

［10］Poy MN，Eliasson L，Krutzfeldt J，et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion［J］.Nature，2004，432 (7014):226-230.

［11］Wu J，Bonsra AN，Du G.pSM155 and pSM30 vectors for miRNA and shRNA expression［J］.Methods Mol Biol，2009，487: 205-219.

［12］Shan ZX，Lin QX，Deng CY，et al.Plasmid-mediated miRNA-1-2 specifically inhibits Hand2 protein expression in H9C2 cells［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2008，28(9):1559-1561，1567.

［13］吳文新，付玉華，沈玉光，等.miR-181a真核表達載體的構(gòu)建及鑒定［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32(2):149-151.