飼用β-甘露聚糖酶的研究進展

謝志恒，崔細鵬，周平發(fā)，史寶軍

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含有β-1,4-甘露糖苷鍵的甘露聚糖及其衍生物（半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖）的內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類，能消除甘露聚糖對單胃動物各種營養(yǎng)物質(zhì)的抗營養(yǎng)作用，其分解產(chǎn)物甘露寡糖在動物腸道中也起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。隨著對自然界半纖維素資源的開發(fā)、飼料β-甘露聚糖抗營養(yǎng)因子的消除以及甘露低聚糖藥用價值，β-甘露聚糖酶的研究和利用已進入一個新階段。

1 β-甘露聚糖酶的來源及理化性質(zhì)

1.1 來源

β-甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中，在一些低等動物如海洋軟體動物翡翠貽貝、蝸牛、淡菜等腸道分泌液中，植物芝麻、番茄、胡蘿卜等種子，豆類植物四棱豆、長角豆、瓜兒豆等發(fā)芽種子以及天南星科植物魔芋粉萌發(fā)的球莖中，微生物細菌中的芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌等，真菌中的曲霉、木霉、青霉等，放線菌中鏈霉菌等都發(fā)現(xiàn)β-甘露聚糖酶活性的存在[2-3]。微生物是飼用β-甘露聚糖酶的主要來源，微生物來源的β-甘露聚糖酶具有很多優(yōu)點，例如酶活性高、生產(chǎn)成本低、提取方便、pH和溫度作用范圍廣以及底物專一性較高，因此已經(jīng)在工業(yè)化生產(chǎn)和理論研究中得到廣泛的應用。

趙娜等從蝸牛肝臟組織中分離出β-甘露聚糖酶[4]。赫崇慧研究發(fā)現(xiàn)番茄中存在甘露聚糖酶，并與多聚半乳糖苷酶、果膠酯酶和纖維素酶之間存在協(xié)同關系，影響著果實的軟化[5]。張清霞等從土壤分離到1株β-甘露聚糖酶產(chǎn)量高的菌株Bacillus sp.N-6，通過比較16S rDNA序列相似性及生理生化性狀鑒定為枯草芽孢桿菌[6]。吳襟等報道了諾卡氏菌形放線菌Nocardioform actinomucetes NA3-540可產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶[7]。程池等以稻草和麩皮為基質(zhì)通過里氏木霉Rut C-30進行固體發(fā)酵，對其產(chǎn)生的非淀粉多糖酶（NSP酶）進行分析，結果表明，里氏木霉Rut C-30產(chǎn)生的NSP酶系較全，其中包括β-甘露聚糖酶[8]。隨著研究不斷深入，越來越多的動物、植物和微生物被陸續(xù)地發(fā)現(xiàn)存在甘露聚糖酶活性。

大量研究表明，微生物生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的機制雖然不盡相同，但大多數(shù)以胞外誘導酶的形式存在于生物體，只有很少的以結構酶形式存在，對于大部分產(chǎn)β-甘露聚糖酶的微生物，在培養(yǎng)基中添加少量的甘露聚糖（例如甘露聚糖、魔芋粉、槐豆膠或其水解物），能極大提高產(chǎn)酶水平。Lin等以脫脂椰子肉（含甘露聚糖）作為碳源進行Aspergillus niger NCH-189發(fā)酵，產(chǎn)酶能力提高400%[9]。隨著微生物生產(chǎn)研究的不斷深入，高產(chǎn)菌株的發(fā)現(xiàn)和發(fā)酵條件的優(yōu)化，β-甘露聚糖酶的微生物產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)進程進一步加速。鄔敏辰等以黑曲霉LW2129菌株三角瓶固態(tài)發(fā)酵試驗為基礎，經(jīng)曲盤固態(tài)發(fā)酵試驗進一步放大到30 m3固態(tài)發(fā)酵罐生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模，酶活性可達干曲26 725～29 218 U·g-1[10]。

1.2 理化性質(zhì)

不同微生物所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶的相對分子質(zhì)量、pH和溫度作用范圍、等電點、酶動力學常數(shù)、底物專一性等都有一定差異。細菌中研究最多的是芽孢桿菌，其產(chǎn)生β-甘露聚糖酶等電點為4.0～5.0，最適pH除嗜堿芽孢桿菌為9.0～10.0外，其余多為5.5～7.0，最適反應溫度為50～70℃，一般都有較強的耐熱性；真菌來源的β-甘露聚糖酶等電點為4.0～5.0，最適pH為4.5～5.5，最適反應溫度為55～75℃，相對細菌而言，其pH的穩(wěn)定性、最適反應pH都偏低，耐熱性也比芽孢桿菌弱；植物細胞產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶最適反應溫度和耐熱性比細菌和真菌低，最適反應pH為4.5～5.5[11-12]。

周芳從土壤中篩選出一株較高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的芽孢桿菌屬菌種，并對其產(chǎn)的β-甘露聚糖酶進行分離純化，此酶最適反應的pH為7.0，最適反應溫度為50℃，＜50℃酶活力穩(wěn)定。酶對魔芋膠、刺槐豆膠和瓜兒豆膠的Km值分別為3.97、8.79和17.56 mg·mL-1，Vmax值分別為 9.02、12.44和 20.92 μmol·min-1·mL-1[13]。朱劼等將純化的黑曲霉Asper?gillus niger WM20-11所產(chǎn)的酸性β-甘露聚糖酶經(jīng)IEF-PAGE測得酶的等電點為4.0，最適pH和溫度分別為3.5和70℃，酶對角豆膠的Km和Vmax分別為 66.7 g·L-1和 333 μmol·min-1·mL-1[14]。

2 β-甘露聚糖酶的分子生物學結構和作用方式

2.1 分子生物學結構

近年來，隨著β-甘露聚糖酶的應用越來越廣泛，對β-甘露聚糖酶研究也不斷深入，其結構研究也取得了突破性進展。目前，對β-甘露聚糖酶的結構研究主要集中在微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶方面，已經(jīng)有十幾種微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶分子生物學結構被解析。研究表明，大部分β-甘露聚糖酶具有催化域和非催化域兩部分，催化域折疊成TIM桶狀結構，參與底物的結合與催化；非催化域是碳水化合物結合域，采用經(jīng)典的三明治結構，可以增強結合有纖維素的甘露糖水解能力，但是有一些復雜的β-甘露聚糖酶不止具有1個催化域。根據(jù)β-甘露聚糖酶催化域的特點，所有已知的β-甘露聚糖酶被分為2個糖苷水解酶家族，即家族5和家族26[15-16]。

細菌中研究最多的是芽孢桿菌產(chǎn)的β-甘露聚糖酶，Ma等從枯草芽孢桿菌N16-5中分離純化出一種堿性β-甘露聚糖酶，該酶的基因（manA）包括一個長1 479 bp的開放閱讀框（ORF），與糖苷水解酶家族5的基因具有高度同源性[17]。近年來真菌來源的β-甘露聚糖酶的結構研究也備受關注，Hag?glund等從里氏木霉產(chǎn)物中分離出的β-甘露聚糖酶基因（Man5A）包括一個N端的催化元件和一個C端碳水化合物結合元件（CBM），Man5A屬于糖苷水解酶家族5，CBM起到結合纖維素的作用，促進纖維素的降解[18]。

2.2 作用方式

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含有甘露糖的多糖水解酶的總稱，一般可分為外切β-甘露聚糖酶和內(nèi)切β-甘露聚糖酶。對于甘露聚糖類物質(zhì)的降解主要依靠內(nèi)切β-甘露聚糖酶，其對底物有嚴格的鍵專一性，即β-甘露聚糖酶能夠降解甘露聚糖酶、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露糖苷鍵，而對其他的化學鍵不起作用。研究證明，β-甘露聚糖酶作用于魔芋膠或槐豆膠的作用位點是多糖鏈上非還原端的第3或第4個糖分子，水解產(chǎn)物為M-G，G-M，G-G，M-M，M-M-M，G-G-M，M-G-M，G-M-M， M-M-M-M， G-M-M-M， G-M-M-G，G-G-M-M，M-M-M-M-M。雖然不同來源的β-甘露聚糖酶對不同底物的作用方式和作用產(chǎn)物不同，但是產(chǎn)物主要是低聚糖，很少或根本不產(chǎn)生單糖。同時在分解甘露聚糖過程中，由于甘露聚糖的結構使得多種主鏈酶、側鏈酶在降解甘露聚糖時會產(chǎn)生協(xié)同作用[19]。在Sclerotium rolfsi中兩種β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的協(xié)同作用使得降解半乳甘露聚糖產(chǎn)生的單體數(shù)量增多，水解產(chǎn)物的總量增加。T.neapolitana 5 068中的耐熱型β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶和α-半乳糖苷酶也可協(xié)同水解半乳甘露糖為單糖[20]。

3 在動物生產(chǎn)中的應用

3.1 促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料消化率

β-甘露聚糖是飼料原料細胞壁的主要組成部分，其能結合大量水分，使消化道內(nèi)容物黏度升高，減少破壁后養(yǎng)分與消化酶的接觸，阻礙已消化養(yǎng)分的擴散和吸收；其也能把淀粉、蛋白質(zhì)、脂類和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)包裹在細胞壁內(nèi)，阻礙機體消化酶對營養(yǎng)物質(zhì)的消化。β-甘露聚糖酶能夠把β-甘露聚糖降解為低聚糖，減少了β-甘露聚糖與水分子的相互作用，從而促進細胞外營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時能把細胞里的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，提高飼料的營養(yǎng)價值和消化率。應琳琳等研究β-甘露聚糖酶對斷奶仔豬消化率的影響，結果表明，在飼料中添加β-甘露聚糖酶可以降低腹瀉率，提高動物的生產(chǎn)性能，可以不同程度地提高日糧營養(yǎng)成分的消化率[21]。付錦鋒等研究甘露聚糖酶對豬生長性能和消化率的影響，結果表明，在含有DDGS 10%和15%的基礎日糧中添加甘露聚糖酶400 U·kg-1，可以提高傳統(tǒng)生長和育肥豬生長性能和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率（P＜0.05）[22]。

3.2 提高飼料能量利用率

在常規(guī)飼料原料中，豆粕中β-甘露聚糖含量最高，為1.3%～1.6%，而豆粕的能量利用率僅為50%～60%，這與豆粕中存在的β-甘露聚糖有很大的關系。馬成杰等研究表明，在櫻桃谷商品肉鴨基礎日糧中添加和美酵素（β-甘露聚糖酶）100 mL，可以提高飼料的能量利用率；降低飼糧代謝能商品肉鴨的生產(chǎn)性能不受影響，其遺傳性能夠發(fā)揮正常，同時可降低飼料成本22.19元·t-1[23]。張輝華等研究β-甘露聚糖酶對肉鴨椰籽粕消化率的影響，試驗結果表明，A組（基礎飼料70%+椰籽粕30%+β-甘露聚糖酶）蛋白質(zhì)消化率與真實消化率比B組（基礎飼料70%+椰籽粕30%）分別高8.04%與7.35%，差異均顯著（P＜0.05）；A組能量利用率與真實利用率比B組分別高3.61%與3.38%，差異均顯著（P＜0.05）[24]。

3.3 改善腸道微生物環(huán)境，提高動物免疫功能

動物胃腸道中存在有益菌和有害菌，當有害菌占優(yōu)勢時，動物會出現(xiàn)各種疾病。β-甘露聚糖酶降解β-甘露聚糖的產(chǎn)物甘露寡糖（MOS）能夠選擇性促進動物胃腸道有益菌大量增殖，使其在胃腸道中形成優(yōu)勢菌群，從而抑制外源菌和胃腸道內(nèi)固有腐敗菌的生長繁殖；MOS還能夠結合細菌表面外源凝集素，從而減少細菌與腸黏膜上皮細胞結合的機會，最終使病原菌排除體外，減輕病原菌對機體的毒害作用，保護腸黏膜的完整性，改善胃腸道微生物環(huán)境。MOS能夠促進細胞分泌含有甘露糖基的糖蛋白，這些糖蛋白可以結合侵入機體的細菌，從而調(diào)節(jié)動物機體的多級免疫反應，提高動物免疫功能。李路勝等選用公母混合的1日齡肉雛雞考察甘露聚糖酶對肉雞腸道微生物和免疫機能的影響，結果表明，與低能日糧組相比，試驗組（低能日糧+甘露聚糖酶500 g·t-1）肉雞的胸腺指數(shù)和新城疫抗體分別提高了29.70%和7.44%，差異顯著（P＜0.05）；在腸道微生物菌群和pH方面，添加甘露聚糖酶與對照組相比均有改善[25]。喬海云等研究甘露聚糖酶對肉雞腸道微生物和免疫指標的影響，測定各組肉仔雞的免疫器官指數(shù)、腸道大腸桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)、腸道內(nèi)容物pH，結果表明，在玉米豆粕型日糧中添加β-甘露聚糖酶可以提高肉雞的免疫性能，降低腸道酸堿度，抑制大腸桿菌，增加乳酸菌等有益菌的數(shù)量（P＜0.05）[26]。

3.4 促進生長激素分泌，提高生長速度

有研究報道，β-甘露聚糖酶能夠顯著提高動物胰島素生長因子（IGF-Ⅰ）水平，改善單胃動物的生長性能（P＜0.05）。IGF-Ⅰ是畜禽的生長調(diào)控因子，生長激素（GH）的促進作用也是IGF-Ⅰ介導的。IGF-Ⅰ作用于生長組織，刺激細胞為氨基酸的利用從而促進蛋白質(zhì)的合成，抑制蛋白質(zhì)的分解，最終導致蛋白質(zhì)的凈增長。韓國清研究β-甘露聚糖酶對仔豬血清中IGF-Ⅰ的影響，結果表明，添加β-甘露聚糖酶的試驗組B、C和D分別比空白對照組A提高了3.22%、2.05%、3.17%，差異不顯著（P＞0.05），但試驗組有增加IGF-Ⅰ含量的趨勢[27]。李海英等試驗結果表明，β-甘露聚糖酶可提高肉仔雞體重4.7%，提高胸肌率8.1%，差異顯著（P＜0.05）[28]。

4 小結

在飼糧中添加β-甘露聚糖酶能夠降解β-甘露聚糖，降低消化道內(nèi)容物的黏度，釋放細胞內(nèi)營養(yǎng)成分，提高飼料轉(zhuǎn)化率和能量利用率，其產(chǎn)物甘露寡糖能夠改善腸道微生物菌群和保護腸黏膜的完整性，減少有害菌的生長繁殖，提高動物的免疫功能，同時β-甘露聚糖酶具有無毒害、無殘留、可降解等優(yōu)點，而且可以降低畜禽糞便中有機物、氮和磷的排放量，緩解發(fā)展畜牧業(yè)與保護環(huán)境之間的矛盾，因此開發(fā)前景十分廣闊。

[1]Perret S,Belaich A,Fierobe H P,et al.Towards designer cellulo?somes in colstridia:mannanase enrichment of the cellulosomes produced by clostridium cellulolyticum[J].Journal of Bacteriolo?gy,2004,186（19）:6 544-6 552.

[2]徐揚,劉起麗,聶國興,等.β-甘露聚糖酶的研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2011,40（4）:34-37.

[3]張婕,趙敏.β-甘露聚糖酶的研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥,2011,24（2）:248-250.

[4]趙娜,王和平,藺日勝,等.蝸牛肝臟β-甘露聚糖酶的分離提取及純化鑒定[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學報）,2008,29（4）:141-146.

[5]赫崇慧.番茄果實中甘露聚糖酶與其它細胞壁降解酶的協(xié)同關系研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2010.

[6]張清霞,周洪友,唐文華.芽孢桿菌N-6的鑒定及其產(chǎn)β-甘露聚糖酶最適條件的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2006,11（3）:36-40.

[7]吳襟,何秉旺.諾卡氏菌形放線菌β-甘露聚糖酶的純化和性質(zhì)[J].微生物學報,2000,40（1）:69-74.

[8]程池,樂易林,熊濤,等.對里氏木霉Rut C-30所產(chǎn)非淀粉多糖酶系的分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30（6）:64-67.

[9]Lin T C,Chen C H.Enhanced mannanase production by sub?merged culture of Aspergillus niger NCH-189 using defatted co?pra based media[J].Process Biochemistry,2004,39（9）:1 103-1 109.

[10]鄔敏辰,徐春梅,李劍芳.β-甘露聚糖酶固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術[J].食品與生物技術學報,2008,27（3）:64-67.

[11]李富偉,周響艷,馮定遠.飼用β-甘露聚糖酶的研究及應用[J].飼料工業(yè),2007,28（2）:16-19.

[12]Chen X,Cao Y,Ding Y,et al.Cloning functional expression and characterization of Aspergillus sulphureus beta-mannanase in Pi?chia pastoris[J].Biotechnol,2007,128（3）:452-461.

[13]周芳.芽孢桿菌M-21 β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生、純化與性質(zhì)研究[D].青島:中國海洋大學,2007.

[14]朱劼,鄔敏辰.黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶學性質(zhì)[J].食品與生物技術學報,2007,26（2）:21-25.

[15]趙月菊,薛燕芬,馬延和.β-甘露聚糖酶的結構生物學研究現(xiàn)狀和展望[J].微生物學報,2009,49（9）:1 131-1 137.

[16]毛紹名,章懷云.β-甘露聚糖酶分子生物學研究進展[J].生物技術通訊,2006,17（6）:995-997.

[17]Ma Y H,Xue Y F,Dou Y T,et al.Characterization and gene clon?ing of a novel β-mannanase from alkaliphilic Bacillus sp.N16-5[J].Extremophiles,2004,8（6）:447-454.

[18]Hagglund P,Eriksson T,Collen A,et al.A cellulose-binding mod?ule of the Trichoderma reesei β-mannanase Man5A increase the mannan-hydrolysis of complex substrates[J].J Biotechnol,2003,101（1）:37-48.

[19]許牡丹,楊偉東,許寶紅,等.微生物β-甘露聚糖酶的制備與應用研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2006,27（9）:31-34.

[20]崔栩,曹云鶴,李瑞國.β-甘露聚糖酶研究進展[J].中國畜牧雜志,2010,46（15）:69-72.

[21]應琳琳,邊連全.β-甘露聚糖酶對斷奶仔豬消化率的影響[J].河南畜牧獸醫(yī),2009,30（2）:8-9,22.

[22]付錦鋒,謝曉暉.甘露聚糖酶和DDGS對豬生長性能和消化率的影響[J].飼料研究,2011（2）:4-7,9.

[23]馬成杰,聶書航,楊冬梅.在商品肉鴨飼料中添加和美酵素飼喂試驗[J].畜牧與飼料科學（奶牛版）,2006（5）:47-48.

[24]張輝華,張智飛,王猛,等.β-甘露聚糖酶對肉鴨椰籽粕消化率的影響[J].飼料研究,2011（8）:4-6.

[25]李路勝,周響艷.甘露聚糖酶對肉雞腸道微生物和免疫機能的影響[J].飼料工業(yè),2010,31（6）:15-18.

[26]喬海云,王海宏,丁宏標.甘露聚糖酶對肉雞腸道微生物和免疫指標的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2010,42（2）:15-19.

[27]韓國清.添加β-甘露聚糖酶對仔豬生長發(fā)育影響的試驗研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2007.

[28]李海英,劉珩,肉孜買買提,等.β-甘露聚糖酶對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響[J].飼料研究,2008（10）:1-3.