淺談應(yīng)用生物反應(yīng)器發(fā)酵估算細(xì)胞量

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淺談應(yīng)用生物反應(yīng)器發(fā)酵估算細(xì)胞量

趙立民 羅乃杰 蔣天華（廣東溫氏食品集團有限公司研究院 廣東 新興 527400）

生物反應(yīng)器作為一種高效能的生產(chǎn)方式，現(xiàn)在越來越受到國內(nèi)獸苗企業(yè)的重視。其在生產(chǎn)中表現(xiàn)出的高效率、高產(chǎn)能、高質(zhì)量，相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝是一次質(zhì)的飛躍。但另一方面，生物反應(yīng)器作為高技術(shù)設(shè)備的體現(xiàn)，其對工藝技術(shù)水平和操作人員的要求也大幅度提高。本人根據(jù)多年生物反應(yīng)器使用經(jīng)驗，談一談在細(xì)胞培養(yǎng)后期階段如何判斷細(xì)胞密度是否達(dá)到峰值。

1 應(yīng)用生物反應(yīng)器的意義

在生產(chǎn)中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到最大生長密度后，就可以接種病毒。該時機選擇的恰當(dāng)與否，直接關(guān)系到病毒抗原的產(chǎn)量與質(zhì)量，是極為重要的操作步驟之一。對于使用片狀載體或固定化床技術(shù)等類型的反應(yīng)器，由于無法直接取樣觀測到細(xì)胞的生長狀態(tài)，需要通過分析反應(yīng)器發(fā)酵的其他參數(shù)進(jìn)行估算。

2 細(xì)胞密度峰值的判定方法

2.1 單個細(xì)胞耗糖法 當(dāng)反應(yīng)器中的細(xì)胞發(fā)酵幾天后，記取細(xì)胞消耗葡萄糖量。然后結(jié)束發(fā)酵，消化反應(yīng)器中的細(xì)胞并計數(shù)，計算出細(xì)胞總量。用細(xì)胞耗糖量除以細(xì)胞總量得到單細(xì)胞耗糖量。在反應(yīng)器發(fā)酵過程中，可以用細(xì)胞耗糖量除以單細(xì)胞耗糖量，得到細(xì)胞總量。

2.2 細(xì)胞耗糖穩(wěn)定法 反應(yīng)器發(fā)酵后，隨著細(xì)胞的增殖，耗糖會逐步增加。當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到最大后，數(shù)目不再增多，耗糖量將維持在一個較為穩(wěn)定的范圍內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞耗糖量連續(xù)3次的測定結(jié)果都較為接近時，即可判定反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到峰值。

2.3 細(xì)胞倍增法 繪制所要培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線圖，計算細(xì)胞倍增時間。根據(jù)反應(yīng)器發(fā)酵時長與細(xì)胞接種量估算出細(xì)胞總量。

2.4 細(xì)胞生長時間法 固定細(xì)胞接種量等參數(shù)，摸索出細(xì)胞發(fā)酵達(dá)到最大密度時的時長。以后每次發(fā)酵參數(shù)保持一致，達(dá)到該時長即達(dá)到最大密度。

2.5 細(xì)胞耗氧量法 有些類型的反應(yīng)器可以顯示所通氧氣的含量曲線，如美國NBS籃式反應(yīng)器。隨細(xì)胞數(shù)目的增多，其耗氧量也將增大。當(dāng)氧氣含量的波動曲線達(dá)到最高且穩(wěn)定的時候，即可判定細(xì)胞密度達(dá)到峰值。

2.6 生長面積法 計算出反應(yīng)器可供細(xì)胞生長的總面積，與平板培養(yǎng)細(xì)胞的方法做比較，考慮細(xì)胞接種量等因素，計算出可長滿反應(yīng)器細(xì)胞生長總面積所需要的時間。

以上各方法中，均能起到估算細(xì)胞量(或細(xì)胞密度峰值)的作用，其中方法2、4較為常用且相對準(zhǔn)確度高；方法3、5使用最為簡便；方法1、6的偏差度則較大。在反應(yīng)器發(fā)酵過程中，以上幾種判定方法綜合使用，效果更佳。

（2012–07–15）

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