辣椒游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

成 妍，馬蓉麗，焦彥生，吳海濤，巫東堂

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西太原 030032）

辣椒（Capsicum annuumL.）原產(chǎn)于中南美洲，明末傳入我國并被廣泛種植，是人們廣為熟知的一種蔬菜和調(diào)味品，它包括有辣味的辣椒（chili pepper）和無辣味的甜椒（sweet pepper）[1]。由于辣椒是常異花授粉植物，雜種優(yōu)勢十分明顯，因此，其單倍體遺傳育種研究具有非常重要的意義。

自1973年王玉英等[2]以躍縣小辣椒為試材進(jìn)行花藥培養(yǎng)獲得植株以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者在辣椒花藥培養(yǎng)研究方面進(jìn)行了大量研究[3-4]，使花藥培養(yǎng)成為目前獲取辣椒單倍體較成熟的技術(shù)，已被應(yīng)用于辣椒的遺傳育種工作中[5-7]。游離小孢子培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)相比，不僅單倍體再生率高，而且避免了愈傷組織和體細(xì)胞胚的產(chǎn)生。同時，小孢子的單倍性和單細(xì)胞特性為遺傳轉(zhuǎn)化提供了好機(jī)會[8-10]。目前，有關(guān)辣椒游離小孢子培養(yǎng)的成功報(bào)道較少，還沒有達(dá)到建立起完善、高頻的小孢子培養(yǎng)再生體系的程度，不能應(yīng)用于遺傳育種或基礎(chǔ)性研究，因此，非常有必要對辣椒游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)及其影響因素進(jìn)行深入細(xì)致的摸索研究。

1 供試材料對胚胎發(fā)生的影響

1.1 基因型

胚狀體的誘導(dǎo)與供體基因型密切相關(guān)。不同基因型植株在同樣的試驗(yàn)條件下，游離小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率差異很大[11]。基因型對小孢子胚胎發(fā)生能力的決定作用主要體現(xiàn)在2個方面：一是基因型的反應(yīng)范圍，二是胚胎發(fā)生頻率的差異[12]。Supena等[13]采用相同的培養(yǎng)條件對印度尼西亞辣椒的10個基因型進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，不同基因型間胚產(chǎn)量差異顯著，胚產(chǎn)量最高的可達(dá)31.5胚/蕾；同時發(fā)現(xiàn)，光皮類型的培養(yǎng)效果優(yōu)于皺皮類型。李春玲等[14]對燈籠椒、牛角椒、羊角椒、線形椒和朝天椒分別進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)除朝天椒05-1007僅獲得小孢子愈傷組織外，其余品種均得到了小孢子愈傷組織和胚狀體。王燁等[15]研究了5個辣椒品種小孢子離體培養(yǎng)前期的存活率，認(rèn)為基因型不同導(dǎo)致對不同預(yù)處理的反應(yīng)不同。

1.2 供體植株的生理狀況

不同栽培環(huán)境、不同花期、不同部位的花蕾，其花粉的生理狀況不同，會導(dǎo)致小孢子胚誘導(dǎo)率的差異[16]。Kim等[17]在人工氣候室采用25℃/20℃的晝夜溫度和16 h/8 h的光周期，小孢子培養(yǎng)的出胚率較高。在無人工氣候室的情況下，可利用溫室和田間具備供體植株適宜生長溫度的季節(jié)，即每年春秋季開展工作。在夏季溫度較高時，采用降溫措施使溫室中溫度低于30℃，在秋季光照不足時進(jìn)行人工補(bǔ)光，以維持植株正常生長。不同花期和不同部位的花蕾由于營養(yǎng)狀況不同，其中適于培養(yǎng)的小孢子所占的比率不同，導(dǎo)致產(chǎn)胚率的差異。進(jìn)行人工整枝、連續(xù)摘除將要開放的花蕾及幼果，可使幼小的適宜取材花蕾發(fā)育良好[18]。

1.3 小孢子發(fā)育時期

小孢子發(fā)育時期通常分為單核期、雙核期和三核期，而并非任何時期的小孢子都適于培養(yǎng)。單核期又分為單核早期、單核中期和單核靠邊期[19]。通常最適宜游離小孢子培養(yǎng)的時期為單核靠邊期。張祖姣等[20]研究了興蔬301不同大小花蕾的細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)辣椒小孢子發(fā)育不同時期花蕾和花藥的大小差異顯著或極顯著，依據(jù)花器官形態(tài)特征可判斷小孢子的發(fā)育時期。張菊平等[21]也認(rèn)為，辣椒小孢子發(fā)育時期與花蕾的外部形態(tài)特征、花藥顏色密切相關(guān)。張芳等[22]對6個不同果形和果味辣椒材料的3個相同取蕾時期的花藥進(jìn)行染色觀察，比較發(fā)現(xiàn)，不同基因型辣椒的相同花器官外部形態(tài)所對應(yīng)的小孢子發(fā)育時期存在一定的差異，但各品種與單核晚期相應(yīng)的花器官外部形態(tài)特征存在共性，即花蕾的花瓣長于萼片0.12 mm，花藥尖部略微紫色（到背面1/3處紫色）時，各個材料的小孢子大部分均處于單核期。

2 培養(yǎng)技術(shù)對胚胎發(fā)生的影響

2.1 分離小孢子的方法

目前，主要是通過自然釋放和機(jī)械擠壓這2種方法得到游離小孢子。Supena等[13]采用液固雙層培養(yǎng)基進(jìn)行小孢子看護(hù)培養(yǎng)，2～3周后花藥正常開裂，將小孢子釋放到培養(yǎng)基中。自然釋放法的優(yōu)點(diǎn)是不會對小孢子造成損傷，但培養(yǎng)效果不佳，研究者多采用機(jī)械擠壓方法[3]。劉凡等[9]、李春玲等[14]首先對花藥進(jìn)行15 d的預(yù)培養(yǎng)，然后采用直接擠壓法得到游離小孢子。Kim等[17]用微型攪拌器高速研磨花藥10 s得到游離小孢子。另外，利用Percoll密度梯度離心來分離膨大的小孢子，可以達(dá)到純化的效果。

2.2 小孢子接種密度

接種密度大小對小孢子培養(yǎng)具有十分重要的作用，它影響胚誘導(dǎo)和小孢子發(fā)育進(jìn)程。Kim等[17]在4×104～16×104個/mL之間設(shè)置了6個不同的小孢子接種密度，發(fā)現(xiàn)每皿產(chǎn)胚量與小孢子接種密度成正比。但密度太大、太小都會影響子葉形胚的產(chǎn)量。采取4×104個/mL的接種密度在培養(yǎng)3周時未見胚狀體產(chǎn)生，隨著培養(yǎng)時間的延長，只能產(chǎn)生極少量的子葉形胚。采取16×104個/mL的接種密度在培養(yǎng)3周時就能產(chǎn)生大量球形胚，但這些球形胚從此停止發(fā)育。最優(yōu)的接種密度是10×104個/mL。

2.3 基本培養(yǎng)基

辣椒游離小孢子培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基主要有CP，NLN，MS等。Mityko等[23]比較了 3 種基本培養(yǎng)基（NLN，R92，CP）的誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)小孢子在NLN培養(yǎng)基中培養(yǎng)時可獲得最多數(shù)量的多細(xì)胞團(tuán)。劉凡等[9]和李春玲等[14]分別采用CP基本培養(yǎng)基進(jìn)行辣椒游離小孢子培養(yǎng)，取得了理想的結(jié)果。Supena等[13]比較了在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行小孢子看護(hù)培養(yǎng)和在AT3培養(yǎng)基上進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)的效果，認(rèn)為前者更適合于辣椒小孢子培養(yǎng)。Kim等[17]在小孢子預(yù)處理時對比了無碳源培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，前者對于胚的誘導(dǎo)更有效。

2.4 碳源

一定濃度的糖類物質(zhì)的添加既可作為碳源，又具有維持培養(yǎng)基滲透壓的作用，常用的糖類物質(zhì)有蔗糖、麥芽糖。Supena等[13]進(jìn)行小孢子看護(hù)培養(yǎng)時使用濃度為2%的麥芽糖。Kim等[17]分別比較了6%，9%和12%的3種蔗糖與麥芽糖對小孢子胚誘導(dǎo)能力的影響，結(jié)果表明，采用添加蔗糖的培養(yǎng)基所獲得的胚狀體不僅在數(shù)量上而且在質(zhì)量上均優(yōu)于麥芽糖，且9%的蔗糖誘導(dǎo)效果最好。王燁等[15]研究表明，無碳源的花藥預(yù)培養(yǎng)對提高小孢子存活率作用明顯。

2.5 活性炭

在培養(yǎng)基中添加活性炭可吸附培養(yǎng)過程中小孢子釋放的毒性代謝物質(zhì)，如ABA和酚類化合物等，從而促進(jìn)小孢子胚的發(fā)生、發(fā)育。陳曉等[11]在辣椒花培試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加活性炭能提高胚狀體的誘導(dǎo)率，0.25%～0.5%范圍內(nèi)的活性炭得到的誘胚率差異不明顯。Supena等[13]在對印度尼西亞辣椒的小孢子看護(hù)培養(yǎng)中，研究了不同活性炭濃度對小孢子培養(yǎng)的影響，表明活性炭對小孢子胚的形成是必需的，且活性炭的最適濃度為1%，低濃度的活性炭可增加小孢子胚總產(chǎn)量和子葉形胚產(chǎn)量，但高濃度的活性炭會影響小孢子胚的成苗。

2.6 溫度脅迫

溫度脅迫是影響小孢子胚狀體發(fā)生的最主要因素。一般來說，從植株上采下花蕾后，直接進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，很難誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。溫度脅迫可改變小孢子發(fā)育途徑，從而阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，沿著胚胎的發(fā)展途徑，最后形成胚[9]。劉廣霞等[24]認(rèn)為，4℃低溫預(yù)處理花蕾能大大提高胚狀體誘導(dǎo)率。王燁等[15]研究表明，4℃的花藥預(yù)培養(yǎng)對提高小孢子存活率作用明顯，并且對5個供試品種都有作用。Supena等[13]認(rèn)為，辣椒小孢子看護(hù)培養(yǎng)首先在4℃下處理花蕾1 d，然后9℃處理接種于固液雙層培養(yǎng)基中的花藥1周，可獲得最佳效果。李春玲等[14]采用35℃的高溫脅迫成功完成了胚胎發(fā)生和成苗。劉凡等[9]認(rèn)為，游離小孢子細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)中以35，32℃預(yù)處理下的出胚率較好，7℃處理下獲得的胚狀體很少，而在溫度處理的不同天數(shù)間差異不明顯。Kim等[17]在（31±1）℃下熱激 3 d，取得了較好的培養(yǎng)效果。

2.7 激素

植物激素是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和伸長的一類活性物質(zhì)。培養(yǎng)基中激素種類和濃度，常對調(diào)控細(xì)胞的分裂、生長和分化起著極為重要的作用[14]。Supena等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在小孢子看護(hù)培養(yǎng)的上層液體培養(yǎng)基中添加2.5 μmol/L玉米素和5 μmol/L IAA能顯著提高小孢子胚總產(chǎn)量和子葉形胚產(chǎn)量。劉廣霞等[24]認(rèn)為，MS培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L的2，4-D或KT可以提高花培效果，較高質(zhì)量濃度的NAA（1.0 mg/L）的胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)到最高。然而，劉凡等[9]研究初步表明，液體培養(yǎng)基中高水平的激素對促進(jìn)胚狀體細(xì)胞的分裂和分化沒有積極作用。同樣，Kim等[17]和李春玲等[14]都采用不含激素的培養(yǎng)基獲得了較高的胚誘導(dǎo)率。

3 雄核發(fā)育和胚胎發(fā)生

接種后能夠膨大的小孢子會繼續(xù)發(fā)育，皺縮的小孢子則死亡。李春玲等[14]研究表明，不同類型辣椒游離小孢子的雄核發(fā)育與胚胎發(fā)生程序相同。小孢子最初的細(xì)胞分裂有均等和不均等這2種方式。脫分化的小孢子可經(jīng)歷胚胎發(fā)生和器官發(fā)生2種發(fā)育途徑，二者之間也可相互轉(zhuǎn)換。小孢子在分裂早期如果突破花粉壁會形成薄壁細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)發(fā)育為愈傷組織，進(jìn)而轉(zhuǎn)向器官發(fā)生途徑。小孢子愈傷組織易形成不定根，也可形成次生胚狀體，但未觀察到不定芽的發(fā)生。辣椒游離小孢子胚胎發(fā)生過程與合子胚發(fā)育過程相似，3周可見球形胚與心形胚，4周出現(xiàn)子葉形胚[17]。胚狀體發(fā)育具有高度不同步性，其中，只有20%的是正常完整的子葉形胚（由胚根、胚軸和子葉3部分組成）[13]。

4 小孢子胚的植株再生

成熟的胚狀體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上，給予適宜的溫度和光照條件，1～2 d可轉(zhuǎn)綠，5 d內(nèi)生根，1～2周便可萌發(fā)為完整植株[17]。胚狀體胚芽、子葉端發(fā)育及萌發(fā)能力明顯低于胚根端[14]。在所有的胚狀體中僅有5%能成苗，而具有2片子葉的胚狀體成苗率可達(dá)100%。正常小植株極易移栽成活[13]。

5 小孢子植株的倍性鑒定及其加倍處理

小孢子植株倍性鑒定的方法主要有染色體計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞測定法、形態(tài)學(xué)鑒定法、細(xì)胞學(xué)特征鑒定法等[25]。劉凡等[9]取繼代培養(yǎng)中生長良好的小孢子苗的葉片，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性分析，結(jié)果表明，獲得的再生株中具有單倍體、雙單倍體以及單倍-雙倍嵌合體植株。由于胚狀體發(fā)育早期鏡檢顯示，分裂細(xì)胞團(tuán)來自小孢子，因此，后二者應(yīng)該是小孢子細(xì)胞團(tuán)分裂分化過程中，染色體自然加倍形成的雙單倍體材料，以及可能在同一細(xì)胞團(tuán)中，部分細(xì)胞染色體發(fā)生了加倍，而部分細(xì)胞沒有染色體加倍產(chǎn)生的混倍體材料。單倍體人工加倍的方法以化學(xué)誘變法最常用，常用的誘變劑有秋水仙堿、氟樂靈、對二氯苯、8-羥基喹啉等，其中，以秋水仙堿加倍效果最好。用秋水仙堿溶液處理根、芽等分生組織，或直接加在培養(yǎng)基中，都可以起到一定的加倍作用。

6 存在問題與展望

目前，辣椒游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在實(shí)踐中還存在很多問題，如：材料不易消毒滅菌，污染嚴(yán)重；花藥壁厚，脆性大，不易獲得干凈高活力的小孢子；小孢子游離后活力容易喪失；在所有誘導(dǎo)產(chǎn)生的小孢子胚中，發(fā)育完整的子葉形胚數(shù)量少；非子葉形胚成苗難；單倍體小孢子植株人工加倍率低等[19]。這些問題困擾著無數(shù)研究者，亟待解決。辣椒已有通過花藥培養(yǎng)而成的品種在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，但小孢子培養(yǎng)育成的辣椒品種還沒有報(bào)道?，F(xiàn)今大部分研究成果仍只停留在實(shí)驗(yàn)室階段，不能投入到實(shí)際生產(chǎn)中去。

在今后的研究中應(yīng)加強(qiáng)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的工作。不僅要研究辣椒小孢子胚胎發(fā)生和小孢子胚植株再生的影響因素，以及小孢子再生植株倍性鑒定和染色體加倍技術(shù)，改進(jìn)培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，建立能穩(wěn)定、高效地獲得純合二倍體的辣椒游離小孢子培養(yǎng)體系，而且要深入探討小孢子發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，為該技術(shù)發(fā)展提供理論依據(jù)。相信在不久的將來，通過國內(nèi)外研究者進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究，辣椒游離小孢子培養(yǎng)必然會有廣闊的發(fā)展前景。

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