牛結(jié)核病診斷方法研究

夏輝 盧國(guó)偉 付剛 （山東省臨朐縣畜牧局 262600)

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牛結(jié)核病診斷方法研究

夏輝 盧國(guó)偉 付剛 （山東省臨朐縣畜牧局 262600)

牛結(jié)核病主要是由牛分支桿菌引起的一種人畜共患傳染病，近年來該病發(fā)病率有所上升，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的危害。目前，牛結(jié)核病的診斷仍然以傳統(tǒng)的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)為主，其他診斷方法有根據(jù)臨床癥狀和病理變化診斷、抗酸染色法、PCR 法、血清學(xué)等方法。為了凈化該病，必須提高診斷方法的敏感性和特異性。為了探索基層獸醫(yī)機(jī)構(gòu)對(duì)該病的診斷方法的應(yīng)用，文章對(duì)這些診斷方法及其優(yōu)缺點(diǎn)做了分析，并指出結(jié)核病基層普查檢測(cè)時(shí)，比較合理經(jīng)濟(jì)的診斷方式是遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和間接ELISA法同時(shí)運(yùn)用。

1 牛結(jié)核病的基本情況

結(jié)核病是由分支桿菌屬的結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支桿菌(M.bovis)和禽分支桿菌(M. avi um)引起的一種嚴(yán)重的人畜共患慢性消耗性傳染病。除感染人外，能引起多種哺乳動(dòng)物和禽類發(fā)病。結(jié)核分支桿菌、牛分支桿菌和禽分支桿菌，分別主要引起人結(jié)核、牛結(jié)核和禽結(jié)核。牛結(jié)核和人結(jié)核可以相互感染，禽結(jié)核也可以感染牛和人類。牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支桿菌引起，能在多種組織器官形成干酪樣壞死、肉芽腫(結(jié)核結(jié)節(jié))和鈣化結(jié)節(jié)病變?yōu)樘卣?。在家畜中，牛最易感染結(jié)核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將牛結(jié)核病列為B類動(dòng)物疫病。

20世紀(jì)50年代我國(guó)出現(xiàn)了牛結(jié)核病的大暴發(fā)，如1955年檢出陽(yáng)性率達(dá)36.4%，以后由于采取了有效措施及長(zhǎng)期努力，使結(jié)核病陽(yáng)性率大大降低并控制在較低水平。1985年和1987年兩次全國(guó)奶牛抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，牛結(jié)核病的患病率分別為5.83%和5.43%。但近年來，隨著個(gè)體奶牛養(yǎng)殖戶的增加，結(jié)核病的陽(yáng)性檢出率在逐年上升。尤其是2003年廣州市某大型奶牛公司下屬奶牛場(chǎng)630頭奶牛有70%患結(jié)核病的情況下，每日仍有2t多病牛奶供應(yīng)廣州市場(chǎng)。目前我國(guó)一些省區(qū)牛結(jié)核病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，已達(dá)到9%甚至更高的陽(yáng)性檢出率。因此，做好牛結(jié)核病的定期檢測(cè)普查工作相當(dāng)重要。筆者所在的臨朐縣是奶牛養(yǎng)殖大縣，在基層獸醫(yī)站利用合理經(jīng)濟(jì)的診斷方式診斷牛結(jié)核病對(duì)當(dāng)?shù)啬膛．a(chǎn)業(yè)的發(fā)展作用更加明顯。

2 臨床癥狀和病理變化

牛結(jié)核病臨床癥狀不典型，感染前期不出現(xiàn)臨床癥狀，而感染后期常出現(xiàn)體弱、厭食、消瘦、呼吸困難、淋巴結(jié)腫大和咳嗽等，這些癥狀在其它疾病中也可見到，因此不具有典型性，故早期臨床診斷不易獲得準(zhǔn)確結(jié)果。病理學(xué)檢查可以根據(jù)特征病變確診，如干酪樣壞死、鈣化、上皮樣細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和吞噬細(xì)胞等，但必須在宰殺后才能進(jìn)行。

3 牛結(jié)核病的診斷方法

3.1 抗酸染色法 病料涂片后進(jìn)行抗酸染色，顯微鏡檢查抗酸性桿菌，本菌的細(xì)胞壁不僅有肽聚糖，還有特殊的糖脂，因?yàn)樘侵挠绊?，致使革蘭氏染色不易著染，但能抵抗30ml/L酸酒精的脫色作用，抗酸染色為紅色，常用齊尼二氏(Ziehl2Neel son)染色法，也可用熒光抗酸染色法。如果組織內(nèi)有抗酸性微生物，并且具有典型的組織學(xué)病變，則可以做出初步診斷。抗酸染色法陽(yáng)性率比較低，但它作為一種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，具有假陽(yáng)性率低，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在牛場(chǎng)中就可進(jìn)行，所以仍有一定的實(shí)用價(jià)值。

3.2 PCR法 PCR技術(shù)自1983年發(fā)明以來，顯示出了靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地用于檢測(cè)疑似結(jié)核病病人的臨床樣品(主要是痰液)，近年來在檢測(cè)牛結(jié)核病方面也有應(yīng)用。Ritelli M等道，將人的一個(gè)巨噬細(xì)胞系用來從臨床樣品中分離擴(kuò)增分支桿菌，收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，再通過半套式PCR檢測(cè)培養(yǎng)物中牛分支桿菌的特異性插入序列IS6110，可以確定有沒有牛分支桿菌感染。劉思國(guó)等根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的牛分支桿菌的pncA基因序列，設(shè)計(jì)引物可擴(kuò)增294bp目的片段，建立了特異性檢測(cè)牛分支桿菌的PCR方法，該方法特異性強(qiáng)，敏感度可達(dá)到50pg，陽(yáng)性樣品符合率為90%，陰性樣品符合率為100%而且有利于結(jié)果的判定和臨床樣品的直接檢測(cè)。但是，商品化試劑盒和各科研部門研制的方法檢測(cè)結(jié)果差異較大。含有少量細(xì)菌的樣品降低了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。由于去除污染的方法、DNA提取步驟、去除酶抑制劑技術(shù)、內(nèi)部和外部控制以及交叉污染的防止措施等差異使得結(jié)果千差萬別。該方法還需要標(biāo)準(zhǔn)化和更加嚴(yán)格的操作步驟，以克服實(shí)驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性問題。

3.3 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn) 目前臨床上應(yīng)用最廣泛的是遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)試驗(yàn)，即結(jié)核菌素試驗(yàn)(tuberculin test)，它是測(cè)定牛結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)方法，也是國(guó)際貿(mào)易的指定方法。對(duì)牛皮內(nèi)注射結(jié)核菌素，并在72h后測(cè)量注射部位腫脹程度。美國(guó)就是采用撲殺結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性牛而消滅了牛結(jié)核病。它的技術(shù)要求不高，但是工作量大，檢出時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，許多因素都可以降低該方法的敏感性和特異性。由于提純結(jié)核菌素(PPD)皮膚試驗(yàn)個(gè)體差異較大，注射劑量和PPD批號(hào)對(duì)牛個(gè)體反應(yīng)均有差異，會(huì)呈現(xiàn)不同的皮膚反應(yīng)，其結(jié)果以皮膚厚度的增加數(shù)為準(zhǔn)，易造成人為誤差。結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性僅能表明在過去某一時(shí)間曾經(jīng)發(fā)生過的一次結(jié)核菌感染，它無法證明目前的結(jié)核菌感染是否為活動(dòng)的，或僅為在機(jī)體的某處有活的結(jié)核菌存在。當(dāng)動(dòng)物發(fā)生某些細(xì)菌或病毒的感染時(shí)，或者使用某些藥物治療及一些不明原因，也可能造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。部分研究者還發(fā)現(xiàn)，該法存在著極強(qiáng)的非特異性，即在相當(dāng)數(shù)量的結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性牛中，既找不出特征病變，又不能分離出結(jié)核菌，或僅僅分離出非典型的分支桿菌，重復(fù)檢疫時(shí)陽(yáng)性率下降，而且妊娠母牛檢出率低，給基層的撲殺工作帶來困難，因此在實(shí)際工作中，用于診斷牛結(jié)核病并不十分理想。

3.4 ELISA法 細(xì)胞免疫隨病情加重而減弱，體液免疫隨病情加重而增強(qiáng)。結(jié)核菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，尤其是在巨噬細(xì)胞內(nèi)。對(duì)結(jié)核菌的免疫，首先是細(xì)胞免疫，其次才是體液免疫，二者是分離的。所以反映細(xì)胞免疫強(qiáng)弱的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，不能檢出所有的結(jié)核病牛，僅以此法檢測(cè)牛結(jié)核病顯然是不準(zhǔn)確的。研究認(rèn)為，結(jié)核病牛血清抗體IgG與正常水平差異顯著，從理論上闡明了檢出血清中抗體以診斷疾病的可能性。結(jié)核菌的IgG抗體的血清水平與病變程度呈正相關(guān)，因此檢測(cè)血清中IgG 抗體的水平對(duì)于疾病的診斷有重要意義。細(xì)胞免疫是主要的免疫方式，PPD是檢測(cè)細(xì)胞免疫，血清學(xué)方法是檢測(cè)體液免疫，所以PPD的檢出率要高于血清學(xué)方法。但是，PPD陽(yáng)性不能全部包括所有抗體陽(yáng)性，且PPD陽(yáng)性牛，也未必有臨床表現(xiàn)，而抗體陽(yáng)性往往意味著病情正在惡化，正是危險(xiǎn)的傳染源，所以從這方面來看，血清學(xué)方法比PPD檢測(cè)更重要。另外，非典型分支桿菌感染及某些寄生蟲病等非特異性因素的干擾，均可引起牛的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性，而體液免疫的水平卻很低，這樣就使得血清學(xué)方法更容易排除假陽(yáng)性。但牛分支桿菌與其他許多分支桿菌具有類屬的抗原性，因此常出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)而干擾牛結(jié)核抗體的檢測(cè)。高云航等以草分支桿菌作為吸收抗原處理待檢血清，吸收其中的非特異性類屬抗體，提高了牛結(jié)核EL ISA的特異性。

4 結(jié)語(yǔ)

牛結(jié)核病的診斷方法有很多，任何檢測(cè)方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，如與細(xì)胞免疫相應(yīng)的淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)和γ－干擾素試驗(yàn)或者因?yàn)椴僮鞣爆?，或者因?yàn)槌杀靖撸迷噭┖蟹派湫晕镔|(zhì)，難以在基層牛結(jié)核病的常規(guī)檢測(cè)中運(yùn)用；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)需要貴重的儀器設(shè)備，技術(shù)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和操作人員的要求較高等原因，使其在基層常規(guī)牛結(jié)核病普查中難以運(yùn)用；目前作為法定檢疫方法，結(jié)核菌素試驗(yàn)仍然是普查檢疫中運(yùn)用的方法，但它有許多不足之處。所以，牛結(jié)核病普查中比較好的做法是，檢測(cè)細(xì)胞免疫的結(jié)核菌素試驗(yàn)和檢測(cè)血清抗體的間接ELISA同時(shí)運(yùn)用，互相彌補(bǔ)不足之處，盡可能的提高檢測(cè)的敏感性和特異性。在凈化牛場(chǎng)時(shí)，ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的病牛，不管結(jié)核菌素試驗(yàn)是否為陽(yáng)性，都應(yīng)該進(jìn)行撲殺處理。結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性而ELISA檢測(cè)陰性的牛，應(yīng)該重復(fù)進(jìn)行結(jié)核菌素試驗(yàn)，再結(jié)合其他的檢測(cè)方法，排除非特異性因素的干擾，以降低經(jīng)濟(jì)損失。

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（2012–04–18）

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