空腸彎曲桿菌的分離鑒定

馬艷輝 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

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空腸彎曲桿菌的分離鑒定

馬艷輝 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

空腸彎曲桿菌是一種人畜共患病致病菌，作為一種食物源性病原菌，空腸彎曲桿菌能引起人和動(dòng)物發(fā)生多種疾病，其治病機(jī)理正在被廣泛的研究，本文主要介紹了目前空腸彎曲桿菌相關(guān)疾病的研究進(jìn)展，以及通過(guò)實(shí)驗(yàn)介紹空腸彎曲桿菌的實(shí)驗(yàn)室分離及鑒定的一般方法。

1 相關(guān)疾病的情況

1.1 原發(fā)性疾病

1.1.1 感染性胃腸炎 空腸彎曲桿菌通過(guò)糞，口途徑傳播，能感染人或動(dòng)物引起急性胃炎，屬人獸共患性疾病，主要癥狀為腹瀉等。空腸彎曲桿菌的黏附、定居、毒素(腸毒素、內(nèi)毒素、細(xì)胞膨脹毒素)及侵襲力為其主要發(fā)病機(jī)制。食物源性疾病包括中毒性疾病及感染性疾病，因攝入被污染的水或食物而導(dǎo)致致病物進(jìn)入機(jī)體而發(fā)病。傳染源常為家禽、肉類、鮮奶。國(guó)外研究表明有23.1%~98%零售的雞肉受空腸彎曲桿菌污染，12%的鮮奶受污染。發(fā)達(dá)國(guó)家加工和消費(fèi)禽肉為主要感染途徑。飲用受空腸彎曲桿菌污染的水、未消毒牛奶及與感染動(dòng)物接觸發(fā)病。發(fā)病常以散發(fā)或暴發(fā)出現(xiàn)并呈現(xiàn)季節(jié)性。

1.1.2 感染性腸外疾病 空腸彎曲桿菌通過(guò)其他途徑感染可引起多種腸外疾病。孕婦及妊娠期動(dòng)物感染易導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)。此外，空腸彎曲桿菌感染性腸炎可并發(fā)腎小球性腎炎和腎小管間質(zhì)性腎炎，并在患者糞便和腎活組織檢查中分離出空腸彎曲桿菌。空腸彎曲桿菌還與膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、眼葡萄膜炎及感染性腦膜炎等疾病有關(guān)。

1.2 并發(fā)癥

急性遲緩性癱瘓性疾病的腦脊液檢查有典型的白蛋白-細(xì)胞分離現(xiàn)象。急性感染性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病、急性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸突性神經(jīng)病、急性感覺(jué)神經(jīng)軸突性神經(jīng)病、急性運(yùn)動(dòng)-感覺(jué)神經(jīng)性神經(jīng)病以及Miller.Fisher綜合征(MFS)，并把這類癱瘓性疾病命名為GBS。主要臨床癥狀為起病急、肌無(wú)力，始于下肢，上肢或四肢同時(shí)發(fā)生，可持續(xù)數(shù)日或數(shù)周。感覺(jué)障礙，癥狀多于4周內(nèi)達(dá)高峰。呼吸肌可受累，部分患者發(fā)生上瞼下垂或眼外肌麻痹。體格檢查可見(jiàn)明顯肢體近端或遠(yuǎn)端無(wú)力，腱反射減低或消失。

綜上所述，空腸彎曲桿菌相關(guān)疾病繁多，傳播途徑及發(fā)病形式多樣，盡管有自限性，發(fā)病率、接觸率高，并發(fā)癥嚴(yán)重且預(yù)后差，近年來(lái)常以食物源性疾病發(fā)病，尤其是免疫力低下者包括獲得性免疫缺陷綜合征、血液病及接受化療等患者易并發(fā)嚴(yán)重腹瀉，且耐藥菌株增加引起局部暴發(fā)。目前其發(fā)病機(jī)制不完全明了，尚無(wú)有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防，因此，研究有效疫苗將成為預(yù)防其感染的最好策略。

2 空腸彎曲桿菌的分離鑒定試驗(yàn)

2.1 材料與方法

2.1.1 培養(yǎng)基 Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基、改良Skirrow氏瓊脂培養(yǎng)基、空腸彎曲菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基及空腸彎曲菌瓊脂配套試劑、布氏肉湯。

2.1.2 主要試劑 新鮮綿羊血；新生牛血清；DNA 聚合酶(5U/μl)、dNTPs。

2.1.3 培養(yǎng)基的制備 Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基：42g培養(yǎng)基溶于1000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻至適當(dāng)溫度，無(wú)菌分裝至5ml EP管中，4℃保存?zhèn)溆?。改良Skirrow氏瓊脂培養(yǎng)基：43g培養(yǎng)基溶于1000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻到50℃左右時(shí)加入7%凍融綿羊血，1%空腸彎曲菌瓊脂配套試劑，無(wú)菌倒平皿，4℃保存?zhèn)溆??？漳c彎曲菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：42g培養(yǎng)基溶于1000ml水中，121℃高壓蒸氣滅菌15min，冷卻到50℃左右時(shí)加入5%新生牛血清，無(wú)菌倒平皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集待宰牛肛門拭子于滅菌Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基，于4℃帶回實(shí)驗(yàn)室，劃線接種于改良Skirrow氏瓊脂培養(yǎng)基，置于42.0℃、10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，挑取疑似菌落，染色鏡檢，并進(jìn)行純培養(yǎng)。于-80℃冰箱保存。

2.1.5 細(xì)菌的鑒定 （1）PCR鑒定。用酚氯仿方法提取細(xì)菌的基因組DNA，調(diào)整DNA濃度為100ng/μL，作為PCR模板?；蛟O(shè)計(jì)的引物(上游引物P1：5'-AGCTAGCT TCGCATAATAACTTG-3'和下游引物P2：5'-GAAGAGGG TTTGGGTGGTG-3')，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段理論長(zhǎng)度為750bp(空腸亞種)和500bp(德萊亞種)。反應(yīng)體系25μl (10×PCR buffer2.5μl，2.5mmol/LdNTP2μl，25mmol/LMg CL22μl，10pmol/μl P1、P2各1uL，5U/μl酶0.2μl，DNA模板2μl，滅菌去離子水補(bǔ)足25.0μl)；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃1min、57℃1min、72℃1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃10min，16℃結(jié)束反應(yīng)，同時(shí)設(shè)參考菌株陽(yáng)性、無(wú)模板對(duì)照。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2 結(jié)果

菌落特征與細(xì)菌形態(tài)在加有7%凍融綿羊血和1%空腸彎曲菌瓊脂配套試劑的改良Skirrow平板經(jīng)42.0℃、10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后長(zhǎng)出透明、凸起、邊緣整齊、直徑1~2mm的菌落形態(tài)，經(jīng)空腸彎曲菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基純化培養(yǎng)48h后，呈無(wú)色透明、白色或棕黃色或淺紅色、圓形、光滑濕潤(rùn)、直徑1~2mm的菌落形態(tài)，染色鏡檢為螺旋形、彎曲桿狀或似飛翔的海鷗形的革蘭氏陰性細(xì)菌。

（2012–02–27）

S852.61+2

B

1007-1733(2012)07-0044-02