犬瘟熱及其診斷技術(shù)

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犬瘟熱及其診斷技術(shù)

黃二平（浙江省金華市金東區(qū)畜牧獸醫(yī)局 321031） 方遠(yuǎn)書（浙江省金華市食品藥品檢驗(yàn)所）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的犬的一種高度接觸性、致死性傳染病。早期雙相體溫?zé)嵝停Y狀類似感冒，隨后以支氣管炎、卡他性肺炎、胃腸炎為特征。病后期可見有神經(jīng)癥狀出現(xiàn)如痙攣、抽搐。部分病例可出現(xiàn)鼻部和角墊高度角化。

本病一年四季均可發(fā)生，但以冬春多發(fā)。本病有一定的周期性，每三年一次大流行。不同年齡、性別和品種的犬均可感染，但以未成年的幼犬最為易感。純種犬、警犬比土種犬易感性高，而且病情反應(yīng)重，死亡率也高。本病最重要的傳染源是鼻、眼分泌物和尿液。感染犬瘟病毒的犬60-90d后，尿液中仍有病毒排出，所以說尿液是很危險(xiǎn)的傳染源，主要傳播途徑是病犬與健康犬直接接觸，也可通過空氣飛沫經(jīng)呼吸道感染。

1 犬瘟熱的概述

1.1 臨床診斷

臨床診斷主要通過本病的流行特點(diǎn)、發(fā)病機(jī)理、臨床特征及類癥病的鑒別。

1.1.1 流行特點(diǎn) 在自然條件下可感染多種犬科野生食肉獸，如小熊貓、貉、貂、黃鼠狼，以及豺、狼、獾等。本病一年四季都可發(fā)生，冬春季多發(fā)。6月齡以內(nèi)的幼犬特別易感染，癥狀典型，死亡率極高。世界各地都有流行。

1.1.2 發(fā)病機(jī)理 感染后病毒主要從鼻咽和呼吸道散布到支氣管淋巴結(jié)和扁桃體進(jìn)行原發(fā)性增殖，引起病毒血癥，病毒分布到全身淋巴器官、骨髓和上皮結(jié)構(gòu)的固有膜。約一半的犬感染后迅速產(chǎn)生抗體，但不出現(xiàn)癥狀。另一半的感染犬體內(nèi)病毒繼續(xù)增殖，廣泛侵害多個(gè)系統(tǒng)的上皮細(xì)胞，而呈現(xiàn)特征性的癥狀。

1.1.3 臨床癥狀 體溫呈雙相熱型。病初以呼吸道炎癥為主，表現(xiàn)為流涕、打噴嚏、咳嗽，常為干咳，嚴(yán)重時(shí)鼻鏡龜裂，呼出惡臭氣體，流膿性鼻液，堵塞鼻孔，張口呼吸呈腹式。肺部聽診，支氣管音粗厲，聞干性羅音或濕性羅音或捻發(fā)音。可視黏膜發(fā)紺，眼瞼周圍有散性出血點(diǎn)，眼瞼干燥，呈膿性眼結(jié)膜炎，角膜潰瘍，甚至穿孔。若以消化道炎癥為主時(shí)，主要表現(xiàn)為食欲不振或廢絕，嘔吐，腹瀉，排出帶有黏液的稀便，有時(shí)帶有血液。在后期出現(xiàn)非化膿性腦炎并導(dǎo)致神經(jīng)癥狀，流涎，空嚼，體重不斷下降，腳墊和鼻過度角質(zhì)化。有時(shí)全身肌肉振顫，轉(zhuǎn)圈，共濟(jì)失調(diào)，口吐白沫，牙關(guān)緊閉，最后抽搐而死。

1.1.4 臨床類癥鑒別 犬瘟熱在臨床上容易與感冒、呼吸道疾病、胃腸炎、犬細(xì)小病毒性腸炎、傳染性肝炎等相混淆，根據(jù)其臨床特征與犬瘟熱進(jìn)行初步鑒別診斷。單純性胃腸炎時(shí)，無雙相熱型、無鼻、眼分泌物等。傳染性肝炎時(shí)，有黃疸等。犬細(xì)小病毒性腸炎嘔吐劇烈、頻繁、飲水后立即發(fā)生嘔吐，渴欲強(qiáng)烈，排出的番茄汁樣血便次數(shù)多、數(shù)量大。感冒時(shí)體溫升高，無雙相熱型，鼻流清涕，無流淚現(xiàn)象。而犬瘟熱雙相熱型，眼、鼻有分泌物，嚴(yán)重時(shí)有膿性分泌物；病犬飲水后較少發(fā)生嘔吐，初便秘，后腹瀉，糞便稀薄、惡臭，有時(shí)混有氣泡和血液；鼻、足墊過度角化；末期常出現(xiàn)腹痛、肌肉振顫等神經(jīng)癥狀，甚至驚厥直至死亡。

1.1.5 病理變化 本病是一種泛嗜性感染，病變分布廣泛。有些病例皮膚出現(xiàn)水皰性皮疹；有些病例鼻和腳底表皮角質(zhì)層增生而呈角化病。上呼吸道、眼結(jié)膜呈卡他性或化膿性炎。肺呈現(xiàn)卡他性或化膿性支氣管肺炎，支氣管或肺泡中充滿滲出液。在消化道中可見胃黏膜潮紅。卡他性或出血性腸炎，大腸常有過量黏液，直腸黏膜皺襞出血。脾腫大。胸腺常明顯縮小，且多呈膠凍狀。腎上腺皮質(zhì)變性。輕度間質(zhì)性附睪炎和睪丸炎。中樞和外周神經(jīng)很少有肉眼變化。

1.2 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷

1.2.1 包涵體檢查 包涵體主要存在于膀胱、膽管、膽囊、腎盂上皮細(xì)胞內(nèi)。取清潔載玻片，滴加生理鹽水1滴，用小刀在膀胱黏膜上刮取上皮細(xì)胞，與生理鹽水混合研勻，制成涂片，置空氣中自然干燥后，用甲醇固定，蘇木精-伊紅染色后鏡檢。細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，細(xì)胞漿呈淡玫瑰色，包涵體被染成紅色。包涵體大多在胞漿內(nèi)，1個(gè)細(xì)胞內(nèi)可能含有1~10個(gè)多形性包涵體，但一般呈現(xiàn)圓形或橢圓形。分別對(duì)用強(qiáng)毒攻毒、注射犬瘟熱疫苗和正常狐貉進(jìn)行檢查，結(jié)果用強(qiáng)毒攻毒的狐貉發(fā)現(xiàn)了膀胱黏膜涂片中有包涵體的存在，而注射犬瘟熱疫苗組和正常對(duì)照組則無包涵體的存在，對(duì)于臨床發(fā)病動(dòng)物檢查同樣可檢查出包涵體的存在。

1.2.2 Dot-ELISA法診斷 用建立的三抗體夾心法Dot-ELISA檢測(cè)犬瘟熱病毒(CDV)抗原，其抗原最低檢出量為1.15mg/ml(0.57625ng/點(diǎn))，經(jīng)與常規(guī)ELISA對(duì)104份自然感染犬的血液白細(xì)胞樣本，60份眼結(jié)膜分泌物樣本，73份脾、肝、淋巴結(jié)等臟器樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的陽性率分別為92.31%、66.67%、83.56%和90.72%、63.29%、81.86%；兩種方法檢出的總陽性率分別為83.54%(198/237)和80.17%(190/237)，總陽性符合率為95.96%，表明兩者呈高度正相關(guān)(r=0.92，P<0.01)。經(jīng)電子顯微鏡觀察驗(yàn)證比較，三抗體夾心法Dot-ELISA檢測(cè)的可信度為94.74%。

1.2.3 免疫組化法診斷 免疫組化技術(shù)是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提下，借助免疫化學(xué)的手段，檢測(cè)抗原(或抗體)在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于人及動(dòng)物傳染病的病原鑒定和快速診斷，極大地提高了傳染病的診斷和防治水平。從腦、脊髓、肺、腸、膀胱、脾和淋巴結(jié)中均可檢出CDV抗原，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺是診斷的最佳組織，脫髓鞘性腦炎和肺炎是犬瘟熱的主要病變。采用過氧化物酶法(PAP)技術(shù)檢查患犬瘟熱性肺炎的病犬組織，認(rèn)為有病變的臟器組織均可檢出CDV抗原，且敏感性明顯高于包涵體檢查。采用PAP和單抗技術(shù)證實(shí)實(shí)驗(yàn)性感染CDV脫髓鞘性腦炎病犬的腦組織中，不論是脫髓鞘部位還是未見明顯病變的白髓的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均可見到病毒抗原。陽性細(xì)胞包括星狀細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、腦膜細(xì)胞和血管周圍的炎性細(xì)胞。采用免疫熒光(IF)技術(shù)研究患犬瘟熱性腦炎病犬的CDV分布情況，結(jié)果從全部病犬的腦組織中均檢出CDV抗原，在灰質(zhì)和白質(zhì)中均可見到病變。在灰質(zhì)中，抗原主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞中，包涵體呈成堆的大的顆粒樣或細(xì)小顆粒狀或粉塵樣聚集在胞漿中；在白質(zhì)中主要存在于星狀細(xì)胞中。采用IF技術(shù)證實(shí)，在人工感染CDV后3~4d，即可從循環(huán)血單核細(xì)胞中檢出CDV抗原，病犬第一次發(fā)熱時(shí)最具傳染性。

1.2.4 犬瘟熱病毒的分離和鑒定 （1）病料的采集：采取何種病料，應(yīng)根據(jù)疾病的類型和病情的發(fā)展情況而定。在體溫開始上升的病毒血癥早期，淋巴組織的感染最為嚴(yán)重，因此最好從淋巴細(xì)胞和淋巴組織分離病毒。對(duì)于急性病獸或急性死亡動(dòng)物，病毒分布于全身各器官，故應(yīng)從臟器中分離病毒。在慢性病例或疾病的中后期多從腎臟或腦組織分離病毒。（2）病毒分離：犬瘟熱病毒能夠適應(yīng)雞胚和多種組織細(xì)胞培養(yǎng)物，但并非所有毒株都能生長(zhǎng)良好。犬瘟熱病毒通過絨毛尿囊膜接種9~11日齡雞胚，經(jīng)3~10代后，于接種后5~7d絨毛尿囊膜增厚，有的可引起豆斑。有報(bào)道認(rèn)為，分離犬瘟熱病毒最好的方法是用犬和貂的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物，接種2~3d后出現(xiàn)圓形多核巨細(xì)胞。巨細(xì)胞容易脫落，而且并非所有的細(xì)胞都形成巨細(xì)胞，故應(yīng)多次仔細(xì)觀察。（3）病毒的鑒定：通過電子顯微鏡檢查、酶標(biāo)SPA染色和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等方法進(jìn)行病毒鑒定。電鏡下觀察可見犬瘟熱病毒粒子呈現(xiàn)多形性，多數(shù)為球形，病毒粒子的直徑為110~550nm之間。核衣殼呈螺旋狀，總長(zhǎng)度為1000nm，螺旋直徑15~19nm，螺旋中心5nm的孔，螺距5~6nm，核衣殼由囊膜包裹，其內(nèi)部為M，厚約5nm，表面為H和F兩個(gè)糖蛋白組成的纖突，纖突長(zhǎng)度為9nm。應(yīng)用酶標(biāo)SPA(葡萄球菌A蛋白)染色法對(duì)接種CDV的Vero細(xì)胞進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，有相應(yīng)CDV抗原部位，同樣滴加CDV陽性血清的對(duì)照細(xì)胞片，未見相應(yīng)反應(yīng)。CDV MD-77株感染后3、6、9、12h，胞漿可見細(xì)小陽性顆粒(呈淡黃色至棕褐色著染)；1d后陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，多見于胞漿，胞漿亦可見大空泡；2d后壞死細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，細(xì)胞間拉網(wǎng)；3~4d后合胞體細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，壞死細(xì)胞呈棕褐色至黑褐色；5d后陽性反應(yīng)主要見于新生細(xì)胞胞漿；6d后合胞體細(xì)胞呈大圓形，陽性反應(yīng)主要見于胞漿；7d后整個(gè)合胞體細(xì)胞呈一棕褐色大團(tuán)塊；8d后大部分細(xì)胞脫落，殘留細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。利用犬瘟熱雞胚成纖維細(xì)胞弱毒疫苗免疫動(dòng)物制備瓊脂擴(kuò)散抗體，并對(duì)患犬瘟熱病貉肝臟中的抗原進(jìn)行檢測(cè)，與電鏡結(jié)果相比較，陽性符合率達(dá)85.7%，陰性符合率為75%，認(rèn)為是一種較為特異、敏感、操作簡(jiǎn)便的方法。

1.2.5 分子生物學(xué)診斷 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是分子遺傳學(xué)的進(jìn)步，大大提高了病毒的診斷水平，特別是核酸雜交、PCR技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了疾病診斷的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性。直接從死亡大熊貓肝臟提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用犬瘟熱病毒的1對(duì)引物擴(kuò)增出了約320bp的片段。此產(chǎn)物經(jīng)純化、序列分析表明，其片段2個(gè)引物間長(zhǎng)度為281bp，與預(yù)計(jì)片段大小相同。此毒株在核苷酸和氨基酸水平與北京犬野毒株、哈爾濱犬野毒株、某疫苗弱毒株、Onderstepoort弱毒株和海豹瘟熱病毒2型毒株的同源性分別為92.2%和98.9%、92.5%和98.9%、91.5%和94.6%、92.9%和98.9%、98.2%和100%。這樣就進(jìn)一步確定了大熊貓的犬瘟熱病毒感染。用地高辛標(biāo)記Ｎ基因互補(bǔ)的特異性RNA探針具有高度敏感性，可查證單個(gè)感染細(xì)胞中存在的目的核酸序列，特異性較強(qiáng)，不產(chǎn)生背景。運(yùn)用RT-PCR已能檢測(cè)出患狗外周血單核細(xì)胞中的犬瘟熱病毒的核衣殼蛋白基因(N)及運(yùn)用pRVSV載體成功表達(dá)了CDV的N基因。

目前，在獸醫(yī)臨床工作中，犬瘟熱的診斷多采用臨床診斷、包涵體檢查和ELISA法。對(duì)于病毒的分離、鑒定，免疫組化法和分子生物學(xué)等診斷方法，尚未推廣應(yīng)用。

2 典型病例診治

2.1 發(fā)病情況

2011年12月20日，金東區(qū)曹宅鎮(zhèn)杜某家的牧羊犬4月齡，咳嗽，拒食，嘔吐，糞便中混有血樣黏液，主人帶狗來本處求診。

2.2 診斷情況

經(jīng)問詢主人得知，該犬于11月初購于市區(qū)一寵物市場(chǎng)，之后一直養(yǎng)在自家，未進(jìn)行過任何疫苗免疫，12月17日開始出現(xiàn)咳嗽。經(jīng)檢查，該犬精神沉郁，眼角有跟眥，鼻部流有黃色膿性分泌物，打噴嚏，不愿活動(dòng)，體溫為40℃，且呈雙相熱，糞便中混有血樣黏液。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀觀察，初步診斷為犬瘟熱。

2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

包涵體檢查：細(xì)心刮取支氣管黏膜上皮細(xì)胞涂片、自然干燥，用甲醇固定，蘇木紫—伊紅染色，鏡檢，在上皮細(xì)胞的胞漿或胞核內(nèi)可見呈圓形或卵圓形、直徑1~2μm、呈紅色的包涵體。

2.4 治療

2.4.1 血清療法 使用犬瘟熱高免血清，2ml/kg體重皮下注射3d，做好緊急被動(dòng)免疫。

2.4.2 對(duì)癥治療 用地噻米松5~20mg肌肉注射，1次/d，具有消炎和解熱作用；大量飼喂VB和VC，選用強(qiáng)心劑、利尿劑及收斂、止吐藥和止咳祛痰藥靜脈注射等。

2.4.3 控制繼發(fā)感染 為防止和控制繼發(fā)感染，按靜脈注射氨芐青霉素20mg/kg體重，肌肉注射。

2.4.4 轉(zhuǎn)歸情況 由于病情發(fā)現(xiàn)的較早，并得到很好的診治，一段有效的治療時(shí)間后，病情好轉(zhuǎn)。犬完全恢復(fù)后，按程序進(jìn)行犬七聯(lián)苗的免疫，做好預(yù)防保健工作。

3 防制措施

3.1 免疫

定期預(yù)防接種是預(yù)防發(fā)生犬瘟熱的有效途徑。據(jù)筆者經(jīng)驗(yàn)，注意以下幾點(diǎn)：（1）采用正規(guī)廠家生產(chǎn)的疫苗，盡量使用聯(lián)數(shù)少的。犬瘟熱一細(xì)小病毒二聯(lián)苗從感觀上比五聯(lián)、六聯(lián)苗有效的多(尚未進(jìn)行完全統(tǒng)計(jì))，筆者曾用人用麻疹疫苗對(duì)7只未斷奶犬和4只斷奶犬進(jìn)行首免，免疫劑量為1.5~2頭份，20d后用犬用五聯(lián)苗二免，二免后3個(gè)月用五聯(lián)苗三免，至今已6~7月齡，未發(fā)生犬瘟熱。（2）美國(guó)獸醫(yī)學(xué)會(huì)曾建議，免疫狀態(tài)不明的3月齡以下犬只應(yīng)給兩劑或三劑以上疫苗。應(yīng)對(duì)斷奶犬用二聯(lián)或五聯(lián)苗首免，免疫劑量2~3頭份，隔3周后二免，12~16周時(shí)三免，劑量為1頭份或2頭份。以后每年接種一次五聯(lián)疫苗。（3）改變接種途徑。文獻(xiàn)記載，靜脈或肌肉注射疫苗免疫產(chǎn)生快、效果好，皮下接種免疫產(chǎn)生慢且不確實(shí)。因此，最好采取肌肉接種方法。

3.2 自繁自養(yǎng)

加強(qiáng)獸醫(yī)衛(wèi)生防疫措施各養(yǎng)殖楊應(yīng)盡量做到自繁自養(yǎng)。個(gè)人養(yǎng)的犬，在本病流行季節(jié)，嚴(yán)禁將犬帶到犬集結(jié)的地方。

3.3 隔離

及時(shí)隔離治療發(fā)現(xiàn)病犬，要及時(shí)隔離治療，防止擴(kuò)大傳播。目前尚無特異的有效療法。發(fā)病早期可應(yīng)用本病康復(fù)犬血清或全血進(jìn)行肌肉或皮下注射，劑量為血清4~5ml，全血10~15ml，有一定療效。此外，早期應(yīng)用抗生素(如青霉素、鏈霉素等)，并配合對(duì)癥治療，對(duì)于防止細(xì)菌性繼發(fā)感染和病犬康復(fù)有重要的意義。

3.4 消毒

用3%燒堿溶液或10%福爾馬林徹底消毒犬舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地。

（2012–08–09）

S858.292

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1007-1733(2012)11-0029-03