MicroRNA在炎癥性腸病中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用于針灸調(diào)控機制研究的思考

豐曉溟,馬曉芃,吳煥淦,趙琛,劉慧榮

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,上海 201203)

克羅恩病(Crohn disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎癥性腸病的兩種主要類型,臨床表現(xiàn)相似,因長期腹痛、腹瀉、便血而影響患者身心健康。近年來,中國人 IBD發(fā)病率有上升趨勢。西醫(yī)治療以控制炎癥反應(yīng)和緩解腸外癥狀為主,但本病發(fā)病機制尚不清楚,使得西醫(yī)學(xué)治療手段受限。中醫(yī)藥尤其是針灸對于IBD的治療有獨特優(yōu)勢[1-3],但其調(diào)節(jié)機制尚有待于進一步揭示。MicroRNA(miRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控 mRNA表達功能作用的小分子RNA,其對免疫系統(tǒng)細胞的發(fā)育分化[4-6]、炎性因子的產(chǎn)生[7]有重要調(diào)節(jié)作用,miRNA在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中的作用已成為近年來研究的熱點。本文綜述miRNA在炎癥性腸病中的研究現(xiàn)狀,并探討從 miRNA角度研究針灸治療炎癥性腸病作用機制的意義和重要性。

1 miRNA的生物合成及生物學(xué)功能

miRNA首先在細胞核內(nèi)由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄為pri-microRNA轉(zhuǎn)錄子[8,9],后者經(jīng)雙鏈的RNA核酸內(nèi)切酶Drosha與DGR8整合,成為長約70個堿基對的莖環(huán),即前體 microRNA(Pre-microRNA)[10]。Pre-microRNA通過輸出蛋白5轉(zhuǎn)運至胞漿,經(jīng)Dicer核酸內(nèi)切酶折疊為小的雙鏈RNA雙螺旋分子,成熟的miRNA整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducing silencing complex,RISC)里。成熟的miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA,長度約22～24個核苷酸,通過識別特定的靶mRNA 的 3’ 非 編 碼 區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)并與之互補配對,從而降解 mRNA或阻遏其翻譯,實現(xiàn)抑制蛋白編碼基因的表達。miRNA的表達模式具有高度保守性、時序性和組織特異性,在不同組織、不同發(fā)育階段中表達水平有顯著差異,是調(diào)控其他功能基因表達的重要分子。目前已知的人類基因組約有1500個miRNAs(http://www.mirbase.org/),對多達1/3的基因發(fā)揮著下調(diào)作用,一個miRNA能調(diào)控上百個蛋白編碼的 mRNA[11],而一個 mRNA又可受多個miRNA調(diào)控[12,13]。miRNAs可不被RNA酶降解,因而能在血漿和體液中有穩(wěn)定表達[14]。大量的研究表明,miRNA可調(diào)節(jié)多種細胞過程,包括細胞周期、細胞分化增殖、凋亡、免疫功能等,從而參與發(fā)育調(diào)控、器官形成、腫瘤生成、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程[15]。miRNAs參與免疫細胞的產(chǎn)生和分化、天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng),且與免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。對miRNAs的深入研究對生物進化探索、基因功能研究、人類疾病防治具有重要意義。

近年來IBD在中國發(fā)病率逐年上升,中國人UC發(fā)病率約為 11.6/105,CD發(fā)病率和患病率分別為0.848/105和2.29/105[16]。雖然CD和UC可通過病史、體格檢查、影像學(xué)、血清標(biāo)志物、內(nèi)鏡和組織化學(xué)等方法鑒別,但仍有 10%的結(jié)腸炎癥無法明確診斷。UC和CD病因尚未完全闡明,可能與患者遺傳易感性、腸黏膜微環(huán)境和腸道異常免疫應(yīng)答有關(guān),有明顯的遺傳危險因素模式和基因及蛋白表達特征[17-22]?；趍iRNA在腫瘤發(fā)生,自身免疫調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,提示miRNA可能成為IBD基因水平發(fā)病和治療的新靶點。與癌癥研究類似的是,目前miRNA在炎癥性腸病中的研究主要圍繞miRNA特異表達譜及診斷學(xué)指標(biāo)的篩選。

2 miRNA在IBD中的研究現(xiàn)狀

炎癥性腸病受到復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。由于mRNA數(shù)量龐大,研究其與炎癥性腸病的關(guān)系十分困難,難以系統(tǒng)地闡釋其復(fù)雜的相互關(guān)系。而目前發(fā)現(xiàn)的 miRNA數(shù)量相對較少,但功能龐大,研究miRNA對炎癥性腸病炎癥過程靶基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控更易闡釋。迄今為止,IBD中miRNA表達譜的研究主要包括IBD患者與健康人的差異表達譜,以及CD和UC患者的差異表達譜研究。盡管CD和UC患者臨床表現(xiàn)相似,但許多研究顯示兩者的發(fā)病機制并不相同,其差異不僅包含免疫反應(yīng)的相關(guān)基因,還涉及纖維化、代謝、生物合成、細胞增殖和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運等多個過程的基因表達差異[19-25]。IBD研究的熱點主要集中在導(dǎo)致CD和UC發(fā)病差異的基因調(diào)控機制,而基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控引起的疾病表型差異也已引起關(guān)注,miRNA負(fù)向調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯過程就是一個重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。

2.1 IBD結(jié)腸中miRNA特異性表達譜研究

2008年的一項研究發(fā)現(xiàn),與健康人比較,活動期UC患者結(jié)腸的 11個 miRNA有表達差異,其中 3個miRNA(miR-192,miR-375和 miR-422b)表達顯著降低,8個 miRNA(miR-16,miR-21,miR-23a,miR-24,miR- 29a,miR-126,miR-195和let-7f)表達顯著升高。而與健康人比較,非活動期 UC患者結(jié)腸 3個miRNA(miR-21,miR-375和 miR-422b)表達增高,4個miRNA(miR-23a,miR-16,miR-24和 miR-29a)表達降低[26]。其中miR-21是IL-6介導(dǎo)的STAT3依賴性miRNA家族,miR-192與促炎因子MIP-2a的表達呈負(fù)相關(guān)。這些差異至少提示兩點,一是 miRNA的異常調(diào)節(jié)可能通過促進活性促炎因子的釋放,而在UC發(fā)病中起關(guān)鍵作用;二是不同的 miRNA的表達差異可能參與結(jié)腸免疫平衡的調(diào)節(jié)和炎癥的維持。

另一臨床研究顯示[27],與健康人比較,活動期 CD患者乙狀結(jié)腸中 miRNA表達上調(diào)的有 miR-23b、miR-106和 miR-191,表達下調(diào)的有 miR-19b和miR- 629;而慢性活動期末段回腸 CD患者結(jié)果顯示,和健康人比較,miR-16、miR-21、miR-223和miR-594在末段回腸活檢樣本中表達上調(diào)。其中,miR-21在牛皮癬[28]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[29]報道有顯著上調(diào);miR-223在克羅恩病及類風(fēng)濕病人T細胞中[30]均有顯著上調(diào)。

以上結(jié)果顯示與健康人比較時,CD和 UC的差異miRNA表達譜較少重疊,提示miRNA參與UC和CD發(fā)病機制也是不同的。深入研究其機制,尚需揭示 miRNA與其靶基因的相互作用以明確miRNA的更多功能。

2.2 IBD外周血miRNA表達譜研究

IBD外周血miRNA特異性表達譜研究可能對IBD診斷學(xué)意義重大,可應(yīng)用于診斷學(xué)指標(biāo)的篩選。盡管腸鏡活檢能夠最直觀地反應(yīng)結(jié)腸組織病變狀況,但是取腸組織活檢使其成為一種侵入性診斷方法。相比之下,循環(huán)血miRNA更易獲取,也易于被患者接受,更具有臨床診斷價值。研究顯示[31],活動期 CD患者外周血miR-362-3p表達最顯著,活動期 UC患者 miR-505、miR-103-2、miR-362-3p表達差異最顯著。且 11種miRNA可區(qū)分活動期UC和CD患者。但該結(jié)果與腸組織結(jié)果并不完全吻合,提示外周血與腸組織存在miRNA組織特異性表達,兩種組織的miRNA差異及功能尚需進一步研究。

另一項新研究發(fā)現(xiàn)希臘CD患者外周血中miR-16、miR-23a、miR-29a、miR-106a、miR-107、miR-126、miR-191、miR-199a-5p、miR-200c、miR-362-3p、miR-532-3p表達與健康人有顯著差異;UC患者外周血miR-16、miR-21、miR-28-5p、miR-151-5p、miR-155和miR-199a-5p與健康人表達有顯著性差異,其中UC患者的miR-155表達最高[32]。

IBD外周血miRNA表達的研究剛剛開展,以上研究提示不同人群的外周血篩選的 miRNA指標(biāo)可能不同,若能在此基礎(chǔ)上進一步大樣本篩選出CD和UC患者外周血特異性表達的 miRNA,則可能會成為鑒別診斷 CD和UC的有效指標(biāo),從而提高臨床的診斷率。而不同種族的miRNA特異性表達譜在IBD患者中尚不多見,仍有待于臨床研究的進一步深入。

3 應(yīng)用miRNA研究針灸調(diào)節(jié)IBD機制的思考

針灸對炎癥性腸病確有療效已得到臨床證實[33,34],機制方面的研究也提示針灸的調(diào)節(jié)作用是多水平、多靶點的。多項研究均顯示針灸能夠從基因水平調(diào)節(jié)炎癥性腸病,應(yīng)用基因表達譜芯片技術(shù)研究UC大鼠結(jié)腸組織的基因表達譜,得到在UC大鼠結(jié)腸中異常表達、隔藥灸治療后得到調(diào)節(jié)的差異表達基因 174條,分析表明艾灸治療對基因表達的影響涉及細胞骨架運動相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因(如 IL-1b、IGF-1等)、基礎(chǔ)代謝相關(guān)基因、炎癥相關(guān)基因等;對UC針灸調(diào)節(jié)分子免疫學(xué)機制的研究發(fā)現(xiàn),隔藥灸與電針能夠降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜中 IL-1b、IL-6、IGF-l mRNA表達及iNOS mRNA表達,上調(diào)IL-1ra mRNA 表達,有效地控制UC已啟動的炎癥和免疫級聯(lián)反應(yīng),促進潰瘍的愈合[35];臨床研究也顯示,艾灸可能是通過下調(diào) UC患者結(jié)腸黏膜IL-8 mRNA的表達,抑制ICAM-1mRNA表達,從而達到治療之目的[33,34]。對克羅恩病針灸調(diào)節(jié)分子免疫學(xué)機制的研究顯示,針灸能顯著降低模型大鼠結(jié)腸黏膜異常增高的TNF-a、IL-12、IFN-g、IGF-l mRNA表達;提升結(jié)腸黏膜異常降低的IL-4、IL-10 mRNA表達[36-38]。這些研究均提示針灸對 IBD的多個炎癥相關(guān)基因具有調(diào)節(jié)作用。

在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用數(shù)量較少、但功能龐大的miRNA研究針灸對炎癥性腸病炎癥過程靶基因復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,將有助于全面深入地剖析針灸干預(yù) IBD發(fā)生發(fā)展的作用機理,揭示針灸調(diào)節(jié)作用的分子基礎(chǔ)。目前尚未檢索到miRNA與中國人炎癥性腸病的關(guān)系及針灸干預(yù)作用的相關(guān)文獻報道。今后,可對中國人炎癥性腸病進行miRNA的篩選、鑒定,初步明確中國人炎癥性腸病相關(guān)的miRNA,了解中國人炎癥性腸病相關(guān)的miRNA表達特點,找出中國人潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病發(fā)病的關(guān)鍵 miRNA及其靶基因,并運用生物信息學(xué)技術(shù)進行分析,構(gòu)建 miRNA-mRNA的共表達網(wǎng)絡(luò),對其參與的主要生物學(xué)功能和信號通路進行整合分析。并在此基礎(chǔ)上,觀察艾灸對于 miRNA及其靶基因的調(diào)節(jié)作用,運用生物信息學(xué)方法找出關(guān)鍵的信號通路中有顯著性差異的miRNA和 mRNA,繼而在細胞模型和動物模型上過表達和低表達相應(yīng)的 miRNA,報告基因載體系統(tǒng)觀察其靶基因的表達狀況,明確miRNA的調(diào)節(jié)靶點,進而闡釋艾灸的治療機理?？梢灶A(yù)見,引入miRNA技術(shù)研究針灸對IBD的調(diào)節(jié)機制,將傳統(tǒng)的中醫(yī)針灸與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段有機結(jié)合,將有助于全面、深入地揭示中醫(yī)針灸調(diào)節(jié)IBD的作用機制,必將推動IBD基礎(chǔ)研究和臨床治療的深入發(fā)展。

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