初培養(yǎng)結(jié)合PCR檢測(cè)精液解脲脲原體感染的臨床應(yīng)用

王建華，王衛(wèi)國(guó)，錢(qián)亞?wèn)|，張紅安

(阜陽(yáng)市人民醫(yī)院，安徽 阜陽(yáng) 236006)

初培養(yǎng)結(jié)合PCR檢測(cè)精液解脲脲原體感染的臨床應(yīng)用

王建華，王衛(wèi)國(guó)，錢(qián)亞?wèn)|，張紅安

(阜陽(yáng)市人民醫(yī)院，安徽 阜陽(yáng) 236006)

目的探討初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR方法檢測(cè)精液解脲脲原體感染應(yīng)用價(jià)值。方法選取120例不育癥患者的精液，分別用PCR、培養(yǎng)加藥敏試劑盒、初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR的方法檢測(cè)解脲脲原體，并與分離培養(yǎng)結(jié)果相比較。結(jié)果120例精液分離培養(yǎng)出62例解脲脲原體，使用PCR法檢測(cè)出30例陽(yáng)性、用培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測(cè)出65例陽(yáng)性、用初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR技術(shù)檢測(cè)出62例陽(yáng)性，以上三種方法與分離培養(yǎng)結(jié)果的總符合率分別為73.3%、97.5%和100%。結(jié)論初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR是一種檢測(cè)精液解脲脲原體的可行性方法。

解脲脲原體；PCR；培養(yǎng)；精液

解脲脲原體是是人類(lèi)泌尿生殖道最常見(jiàn)的寄生菌之一，可以引起多種疾病，若上行感染引起男性前列腺炎或附睪炎，可導(dǎo)致不育癥的發(fā)生[1，2]。目前檢測(cè)生殖道解脲脲原體的方法基本上采用PCR或培養(yǎng)加藥敏試劑盒，由于精液相對(duì)于其他生殖道標(biāo)本，較為特殊，目前這兩種被廣泛采用的方法對(duì)于檢測(cè)精液中解脲脲原體是否合適，相關(guān)報(bào)道極為少見(jiàn)。為此，我們通過(guò)PCR、培養(yǎng)加藥敏試劑盒以及初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR方法檢測(cè)精液中解脲脲原體，并與分離培養(yǎng)結(jié)果(當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)解脲脲原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”)相比較，分析何種方法更適合檢測(cè)精液中的解脲脲原體。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年5月至2011年7月就診于阜陽(yáng)市人民醫(yī)院生殖科的120例男性不育患者精液，年齡18～47歲，所選對(duì)象無(wú)梅毒、淋病、尖銳濕疣、生殖器皰疹，無(wú)細(xì)菌性尿路感染，無(wú)衣原體和人型支原體感染，無(wú)艾滋病毒感染。所選患者在檢測(cè)前禁欲5d，標(biāo)本采集前排空尿液，消毒外尿道口，收集所有的精液于無(wú)菌的容器中，立即送檢。

1.2 試劑和儀器 PPLO培養(yǎng)基(上海博華生物科技有限公司)，馬血清(廣州蕊特生物科技有限公司)，解脲脲原體熒光定量PCR試劑盒(廣州達(dá)安公司)，生殖道支原體培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)試劑盒(鄭州安圖生物有限公司)，瑞姬染液(廣州偉伯化工有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 PCR直接檢測(cè) 取充分混勻精液100 μl，加入無(wú)菌生理鹽水1 ml洗滌2次，15 000r/min離心10 min，留取沉淀物，加入100 μl的DNA提取液，100℃加熱10min，取上清2μl作為PCR檢測(cè)模板，熒光定量PCR檢測(cè)按檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測(cè) 加入100 μl培養(yǎng)液于陰性對(duì)照孔后，加入100μl精液于培養(yǎng)液內(nèi)，混勻后用100μl移液器分別加入各培養(yǎng)孔，液體石蠟封閉；剩余培養(yǎng)液勿棄，加入液體石蠟后蓋緊瓶蓋同培養(yǎng)板相同條件培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，。各培養(yǎng)孔不變色為陰性，對(duì)照孔和鑒定孔變?yōu)榧t色而計(jì)數(shù)孔沒(méi)有變色，表明感染量小于104CCU/ml，若對(duì)照孔、鑒定孔及計(jì)數(shù)孔都變紅色，表明感染量≥104CCU/ml。

1.3.3 初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR檢測(cè) 取方法(1.3.2)的培養(yǎng)產(chǎn)物100 μl，15 000r/min離心沉淀，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，留取沉淀物，提取DNA，熒光定量PCR檢測(cè)按檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 解脲脲原體分離培養(yǎng) 取100 μl精液加入到以PPLO肉湯(內(nèi)配有馬血清、酵母浸液、尿素等)中，5%CO2、37℃培養(yǎng)24～48h，觀察培養(yǎng)液顏色變化，由黃色變成紅色時(shí)，即判為陽(yáng)性。陽(yáng)性樣本轉(zhuǎn)種于新的液體培養(yǎng)基和相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，置于微厭氧環(huán)境中作次代培養(yǎng)，以放大鏡觀察菌落形態(tài)，同時(shí)將液體培養(yǎng)物離心后涂片，作姬姆薩染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

所選120份精液樣本，有62例分離培養(yǎng)出解脲脲原體，用PCR直接檢測(cè)標(biāo)本，共檢測(cè)出30例陽(yáng)性，與培養(yǎng)分離結(jié)果比較，陽(yáng)性符合率48.4%，陰性符合率為100.0%，總符合率為73.3%，用培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測(cè)出65例陽(yáng)性，與培養(yǎng)分離結(jié)果比較，陽(yáng)性符合率100%，陰性符合率為94.8%，總符合率為97.5%，用初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR檢測(cè)出62例陽(yáng)性，與培養(yǎng)結(jié)果比較，陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率均為100%。培養(yǎng)加藥敏試劑盒方法與初培養(yǎng)結(jié)合PCR法檢測(cè)解脲脲原體的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但明顯高于PCR直接檢測(cè)的結(jié)果(P＜0.05)。

3 討論

解脲脲原體是人類(lèi)泌尿生殖道最常見(jiàn)的微生物之一，正常情況下，與宿主共存，不表現(xiàn)感染癥狀，但在特定的條件下可以引起機(jī)會(huì)性感染。解脲脲原體感染后，可產(chǎn)生侵襲性酶如磷脂酶等，破壞宿主細(xì)胞膜上的磷脂，阻礙宿主細(xì)胞的生物合成，也可產(chǎn)生尿素酶，生成代謝產(chǎn)物氨，直接對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，同時(shí)產(chǎn)生IgA蛋白酶，破壞泌尿生殖道黏膜局部的抗感染能力，由此導(dǎo)致泌尿生殖道感染性疾病的發(fā)生。解脲脲原體感染可以引起睪丸附睪炎、慢性前列腺炎，由于解脲脲原體可吸附于精子表面，阻礙精子運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸酶樣物質(zhì)干擾受精過(guò)程，而且其與精子存在共同抗原，引起機(jī)體對(duì)精子的交叉反應(yīng)，造成免疫損傷，故解脲脲原體感染是男性不育癥的常見(jiàn)原因之一[2，3]。

由于精液相對(duì)于其他標(biāo)本如泌尿生殖道分泌物、中段尿，較為特殊，一方面精液成分非常復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)方法的干擾因素多，另一方面留取精液的過(guò)程較為繁瑣，標(biāo)本極易受到污染，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)前對(duì)解脲脲原體檢測(cè)的常用方法是PCR、培養(yǎng)加藥敏試劑盒，這兩種方法對(duì)檢測(cè)精液解脲脲原體的適用性，報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用PCR直接檢測(cè)精液解脲脲原體，與分離培養(yǎng)結(jié)果比較，陽(yáng)性符合率僅為48.4%，說(shuō)明此法的靈敏度不夠。由于精液中存在黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶、脂類(lèi)和多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)均是PCR反應(yīng)抑制物，而且煮沸法提取精液DNA時(shí)，并不一定能使DNA與結(jié)合蛋白完全分離，這些物質(zhì)還可能對(duì)DNA產(chǎn)生物理包裹作用，不能使其與DNA聚合酶接觸，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增檢測(cè)的靈敏度降低，雖然在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)精液的洗滌可以部分減少PCR抑制物，但也很有可能造成解脲脲原體的丟失，所以造成PCR直接檢測(cè)精液中解脲脲原體的靈敏度不足。我們用培養(yǎng)加藥敏試劑盒檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有3例標(biāo)本產(chǎn)生假陽(yáng)性，說(shuō)明此法的特異性不很理想，由于這種類(lèi)型的試劑盒，均利用解脲脲原體分解精氨酸或尿素使培養(yǎng)基發(fā)生顏色變化，來(lái)判斷其生長(zhǎng)與否，由于精液在留取過(guò)程中條件難以控制，標(biāo)本很可能受到細(xì)菌污染，而且非淋球菌性泌尿生殖道感染大部分都是混合感染，雖然培養(yǎng)基中加入了青霉素、醋酸鉈等抗生素，破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁防止雜菌生長(zhǎng)，但不能抑制革蘭陰性菌增殖，并且當(dāng)前微生物對(duì)抗生素的抗性越來(lái)越強(qiáng)[4-7]，很有可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)利用初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR的方式檢測(cè)精液中解脲脲原體，與培養(yǎng)分離結(jié)果相比，完全符合，由于經(jīng)過(guò)初培養(yǎng)和洗滌后，PCR抑制物會(huì)急劇減少，同時(shí)利用PCR檢測(cè)的特異性對(duì)培養(yǎng)物再次鑒定，整個(gè)方案簡(jiǎn)單易行。

本實(shí)驗(yàn)證明，PCR技術(shù)直接檢測(cè)精液中的解脲脲原體并不合適，而當(dāng)前使用最為廣泛的培養(yǎng)加藥敏試劑盒，雖然靈敏度很好，但有一定的假陽(yáng)性，對(duì)臨床診斷可能會(huì)造成一定的誤導(dǎo)[6]，培養(yǎng)分離的方法操作復(fù)雜，條件要求高，并不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室，以前使用的血清學(xué)方法已被證明意義不大，而本實(shí)驗(yàn)所采用的初培養(yǎng)產(chǎn)物結(jié)合PCR方法能較好解決精液解脲脲原體感染的診斷，簡(jiǎn)單易行，值得臨床應(yīng)用。

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Initial culture binding PCR assay for the detection of infection of Ureaplasma urealyticum in semen

WANG Jianhua,WANG Weiguo,QIAN Yadong,et al.Department of Clinical Laboratory,The People's Hospital of Fuyang,Anhui Fuyang 236006,China.

ObjectiveTo explore the applied value of using initial culture binding polymerase chain reaction(PCR)assay for the detection of infection of Ureaplasma urealyticum in semen.MethodsThe semen samples were collected from 120 sufferers with sterility,Ureaplasma urealyticum were detected by 3 methods:PCR,culture,initial culture binding PCR,respectively,and the results were anglyzed.ResultsOf the 120 samples,Ureaplasma urealyticum were isolated in 62 cases by isolation and culture,positive in 30 cases by PCR,positive in 65 cases by culture and drug susceptibility kit,and positive in 62 cases by initial culture binding PCR.Compared with isolating culture method,the coincidence was 73.3%,97.5%and 100%respectively.Conclusion Initial culture binding PCR is a kind of feasible means to detect Ureaplasma urealyticum in semen.

Ureaplasma urealyticum;Polymerase chain reaction;Culture;Semen

R446.5,R375+.3

B

1674-1129(2012)04-0361-03

王衛(wèi)國(guó)

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.017