蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞定位影響基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平的研究

楊軍，陳曉黎，王一理，司履生

·論著·

蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞定位影響基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平的研究

楊軍，陳曉黎，王一理，司履生

目的研究表達(dá)產(chǎn)物的不同亞細(xì)胞定位對(duì)基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平的影響，為基因疫苗的設(shè)計(jì)提供參考。

抗體生成； 免疫療法； 核定位信號(hào)； 基因免疫

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(4):270-275

基因免疫不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定程度的體液免疫反應(yīng)，為包括病毒性疾病在內(nèi)的傳染病的免疫預(yù)防以及腫瘤的免疫治療提供了一條新的途徑[1-3]。然而，在某些病毒性感染的免疫預(yù)防中能否誘導(dǎo)機(jī)體高水平的體液免疫應(yīng)答、產(chǎn)生高效價(jià)的保護(hù)性抗體是成功預(yù)防的關(guān)鍵，例如在人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染的預(yù)防中，針對(duì) HPVL1 蛋白的體液免疫反應(yīng)發(fā)揮重要作用。此外，基因免疫方法的出現(xiàn)無疑也為蛋白和肽類抗原抗體的制備提供了一種新的技術(shù)路線，但是，基因免疫雖能高效誘導(dǎo)功能性 CD8+CTL 應(yīng)答，而誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平卻通常有限[4]，這成為嚴(yán)重制約基因疫苗在預(yù)防免疫中應(yīng)用的最大障礙之一。因此，研究不同因素對(duì)基因免疫應(yīng)答的影響，提高基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平，無論是對(duì)基因疫苗能否成功用于感染性疾病的免疫預(yù)防還是通過基因免疫途徑制備高效價(jià)抗體均具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

提高基因疫苗的免疫效果一直是基因疫苗研究的重要內(nèi)容之一[5-7]。眾多學(xué)者試圖通過采用基因槍、電穿孔等不同的免疫途徑和免疫佐劑以及優(yōu)化表達(dá)載體的調(diào)控元件，或者在表達(dá)產(chǎn)物上游加入分泌性前導(dǎo)序列等方式，以期提高基因免疫所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平，獲得高效價(jià)的特異性抗體。但是，表達(dá)產(chǎn)物本身在細(xì)胞內(nèi)的不同定位對(duì)基因免疫誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平的影響卻知之甚少。本研究通過構(gòu)建能表達(dá)不同細(xì)胞定位的 EGFPHPV16L1 融合蛋白和 EGFP-HPV16L1△NLS 融合蛋白的重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNAEGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體，研究表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的不同定位對(duì)基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、載體和引物 pcDNA3.1(+) 真核表達(dá)載體購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；DH5α 菌株、CHO 細(xì)胞株以及 Sf-9 細(xì)胞株均為本室保存；pFB-EGFP-HPV16L1、pFB-EGFP-HPV16L1△NLS輔助表達(dá)載體和重組 Bac/B-EGFP 桿狀病毒由本室楊軍博士構(gòu)建并保存。EcoR V、XhoI 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物（大連）公司；HRP-IgG 購(gòu)自丹麥DAKO 公司；PCR beads 購(gòu)自美國(guó) Phamasia 公司；ProBondTMColumn 樹脂購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司。PCR 引物（表 1）由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇 6 ～ 8 周齡健康 SPF 級(jí)近交系雌性 BALB/c 小鼠 18 只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2007-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證 SYXK（陜）2001-003。在 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。

表1 PCR 引物Table 1 Sequences of oligonucleotide primers used in PCR experiments

1.2 方法

1.2.1重組 pcDNA 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用PCR 技術(shù)，用 P1 和 P4 引物從 pFB-EGFPHPV16L1 質(zhì)粒中擴(kuò)增 EGFP-HPV16L1 融合基因片段，用 P1 和 P5 引物從 pFB-EGFP-HPV16L1 △NLS 質(zhì)粒中擴(kuò)增截短型 EGFP-HPV16L1△NLS融合基因片段（刪除編碼 HPV16 L1 核定位序列的核苷酸片段 1447 ～ 1518 bp），并分別將其插入 pcDNA3.1(+) 真核表達(dá)載體多克隆酶切位點(diǎn)EcoR V 和XhoI 之間構(gòu)建重組 pcDNA-EGFPHPV16L1 和 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體（圖 1）；以上重組載體經(jīng)雙酶切、PCR 及基因測(cè)序證實(shí)構(gòu)建正確。用 Qiagen tip500 進(jìn)行質(zhì)粒的提取和純化。紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的A260和A280，進(jìn)行 DNA 定量，終濃度調(diào)節(jié)至 100 μg/μl。同法制備 pcDNA3.1(+) 空質(zhì)粒 DNA 作為對(duì)照。

1.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞 用含 10％ 胎牛血清的 RP2MI1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng) CHO 細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染前 18 h，將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的 CHO 細(xì)胞，以胰蛋白酶（2.5 g/L）消化傳代。將 CHO 細(xì)胞均按每孔約為 2 × 105個(gè)細(xì)胞接種于 6 孔培養(yǎng)板中，至細(xì)胞密度大約為 60％ 時(shí)，配置以下溶液：A 液（5 μl 重組的 pcDNA 質(zhì)粒加入 95 μl 滅菌去離子水）與 B 液（6 μl Cellfectin 加入 94 μl 滅菌去離子水）輕輕混勻，室溫放置 30 min；用無血清、無抗生素的 RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 3 次后，逐滴加入 AB 混合液，培養(yǎng) 10 h 后更換完全培養(yǎng)基共培養(yǎng) 3 d，具體方法參照 Invitrogen 公司cellfectin 操作手冊(cè)。倒置熒光顯微鏡下觀察 EGFP標(biāo)記的融合蛋白的表達(dá)。

1.2.3重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物 BALB/c 小鼠隨機(jī)分為 3 組，每組 6 只。分別為 I 組：pcDNA-EGFPHPV16L 重組表達(dá)載體免疫組；II 組：pcDNAEGFP-HPV16L1△NLS 重組表達(dá)載體免疫組；III組：pcDNA3.1 空質(zhì)粒免疫組，進(jìn)行雙側(cè)股四頭肌肌肉注射免疫。用 0.25％ 布比卡因（50 μl/只）行雙側(cè)股四頭肌肌肉注射以提高肌肉攝取質(zhì)粒 DNA的能力，72 h 后開始免疫，DNA 量為每側(cè)肢體100 μg，每只鼠總量 200 μg。間隔 2 周免疫一次，共 3 次。每次免疫前尾靜脈采血，末次免疫后第14 天眼球后取血并脫頸處死動(dòng)物。

圖1 重組 pcDNA 真核表達(dá)載體的構(gòu)建Figure 1 Schematic map of pcDNA expression plasmids with various EGFP tagged insert of deletion mutants of HPV16L1

1.2.4ELISA 法檢測(cè)血清抗體 在 35 mm 培養(yǎng)皿中 27 ℃ Grace′s 完全培養(yǎng)液培養(yǎng) Sf-9 細(xì)胞至80％ 融合時(shí)，更換含 2％ 胎牛血清的 Grace′s 培養(yǎng)液，加入 400 μl 重組 EGFP 桿狀病毒[8]共培養(yǎng)72 h 收集培養(yǎng)上清，倒置熒光顯微鏡觀察 EGFP的表達(dá)，用 ProBondTMColumn 樹脂非變性法純化EGFP 蛋白并定量，具體方法參照 Gibco 公司Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)。用純化的EGFP 蛋白包被 96 孔酶標(biāo)，每孔加 EGFP 蛋白0.1 μg，置濕盒中，37 ℃，孵育 1 h 后置 4 ℃ 過夜；5％ 脫脂奶封閉，37 ℃，2 h；抗血清 1∶100 稀釋倍后，100 μl/孔加入抗原孔，每份樣品均設(shè) 3 個(gè)平行樣，同時(shí)設(shè)空白組。37 ℃，孵育 2 h，TBST 洗板，3 × 5 min；加入 1∶5000 稀釋的羊抗鼠二抗（IgG-HRP）100 μl，37 ℃ 孵育 1 h，TBST 洗板，3 × 5 min；加入底物液 100 μl 顯色，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)自動(dòng)分析儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)其吸光度（A值），比較組間A值的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜ 0.05 為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組 pFast-Bac 輔助表達(dá)載體的構(gòu)建

1％ 瓊脂糖電泳檢測(cè)，重組 pcDNA-EGFPHPV16L1 和 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體，大小與理論值一致（圖 2）。PCR 及雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)重組 pcDNA3.1 表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 PCR 法鑒定重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 質(zhì)粒中的融合基因Figure 2 Identification of recombinant pcDNA-EGFPHPV16L1 and pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS plasmids by PCR

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞

用重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNAEGFP-HPV16L1NLS △真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：在重組pcDNA-EGFP-HPV16L1 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光集中于細(xì)胞核內(nèi)；而在重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1NLS △真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光滯留于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，CHO 細(xì)胞核內(nèi)無綠色熒光（圖 3）。

圖3 重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 Photographic images of CHO cells transfected with indicated expression vectors pcDNA-EGFP-HPV16L1 or pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS for EGFP-HPV16L1 or truncated EGFP-HPV16L1△NLS protein expression, respectively

2.3 ELISA 法檢測(cè)血清抗體

ELISA 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用重組 pcDNA3.1 真核表達(dá)載體免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性 IgG抗體，且用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)其抗體吸光度發(fā)現(xiàn)，隨著免疫次數(shù)的增加，血清抗體吸光度隨之升高，同時(shí)，免疫 3 次之后，重組 pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體免疫組小鼠血清IgG 吸光度顯著高于重組 pcDNA-EGFP-HPV16L真核表達(dá)載體免疫組小鼠血清 IgG 吸光度（P＜0.001）（圖 4）。

圖4 重組 ELISA 分析 pcDNA3.1 誘發(fā)的特異性 IgG抗體水平（5％ 誤差線）Figure 4 Anlalysis of specific IgG antibodies level in the sera from mice immunized with the recombinant pcDNA3.1 plasmids as indicated by ELISA (5％ error line)

3 討論

DNA 疫苗在宿主體內(nèi)表達(dá)的過程與自然過程相似，以自然的形式被加工，并以天然構(gòu)象提呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng)，這種蛋白的空間結(jié)構(gòu)接近天然構(gòu)型，抗原性強(qiáng)，且不存在抗原表位改變或丟失的情況以及蛋白純化的問題，同時(shí)，DNA 疫苗具有免疫原的單一性，只有編碼所需抗原的基因被導(dǎo)入細(xì)胞得到表達(dá)，才能增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答，在很大程度上降低了非特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生。此外，DNA 疫苗具有能長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)。此前認(rèn)為，雖然 DNA 疫苗能高效誘導(dǎo)或產(chǎn)生功能性 CD8+CTL應(yīng)答，但通常只能誘導(dǎo)微弱的體液免疫應(yīng)答。因此，提高 DNA 免疫誘導(dǎo)的體液免疫水平具有重要意義。

人乳頭瘤病毒 16 型 L1 蛋白（human papillomavirus 16 type L1 protein，HPV16 L1）是HPV16衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其羧基端具有 2 個(gè)經(jīng)典的 NLS：?jiǎn)谓M分 NLS（499KRKKRK）和包含單組分NLS 的雙組分 NLS（484KRKatpttsststta499K RKKRK）[9]，在 HPV 生命周期中 L1 蛋白先后兩次被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核內(nèi)參與病毒的成功感染和子代病毒的順利組裝[10-11]，其所誘導(dǎo)的中和抗體對(duì)HPV16 感染具有保護(hù)作用。因此，研究 L1 蛋白對(duì) DNA 疫苗所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平的影響、制備抗 L1 蛋白的特異性抗體對(duì)于預(yù)防 HPV 感染具有重要意義。

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)，分別獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhance green flurenscent protein, EGFP）基因[12-14]標(biāo)記的全長(zhǎng)HPV16L1 基因（包含 HPV16L1 NLS）和刪除HPV16L1基因 3′ 端 NLS（1447-1518 bp）的截短型 HPV16L1△NLS 基因，并將其重組入 pcDNA3.1真核表達(dá)載體，獲得 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 重組真核表達(dá)載體。在本研究組前期研究 HPV16L1 核漿運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力學(xué)過程中業(yè)已證實(shí)位于 HPV16L1 蛋白羧基端NLS 的 23 個(gè)氨基酸（484GKRKATPTTSSTSTTAK RKKRKL506）具有完全核定位作用，能引導(dǎo) HPV16 L1 蛋白和 EGFP 突破核膜屏障進(jìn)入 Sf-9 昆蟲細(xì)胞核內(nèi)，而無 NLS 標(biāo)記的 EGFP 的綠色熒光均勻分布于 Sf-9 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，而 EGFPHPV16L1△NLS 蛋白的綠色熒光局限于 Sf-9 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在此基礎(chǔ)上，在本研究中發(fā)現(xiàn)重組pcDNA-EGFP-HPV16L1 真核表達(dá)載體表達(dá)的攜帶HPV16L1 NLS 的 EGFP-HPV16L1 融合蛋白能在被表達(dá)之后順利轉(zhuǎn)運(yùn)入 CHO 細(xì)胞核內(nèi)，而由重組pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體表達(dá)的刪除 HPV16L1 NLS 的截短型 EGFPHPV16L1△NLS 融合蛋白在被表達(dá)之后卻一直滯留于 CHO 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，說明 HPV16L1 NLS 具有核定位功能，且 NLS 決定了表達(dá)產(chǎn)物的最終亞細(xì)胞定位（圖 3）。

本研究采用肌肉注射方式分別將 pcDNAEGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS重組真核表達(dá)載體注射入小鼠股四頭肌內(nèi)，并用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的 EGFP 蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，通過 ELISA 方法檢測(cè) IgG 抗體A450，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然上述兩種重組真核表達(dá)載體均可誘發(fā)機(jī)體體液應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗-EGFP抗體，但是重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平顯著高于重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 真核表達(dá)載體所誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平（P＜ 0.01）?？梢?，具有相似氨基酸組成和蛋白結(jié)構(gòu)的蛋白產(chǎn)物，由于表達(dá)后蛋白產(chǎn)物的不同亞細(xì)胞定位可對(duì)基因免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平產(chǎn)生顯著影響，刪除 NLS 的蛋白由于滯留于宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而誘發(fā)更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，這可能與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白分子較細(xì)胞核內(nèi)蛋白分子更容易被釋放到組織間隙而被抗原提呈細(xì)胞捕獲、加工并提呈給 CD4+T 細(xì)胞，誘發(fā)特異性體液免疫應(yīng)答反應(yīng)的緣故。

此前，F(xiàn)an 等[15]研究已證實(shí)分泌性蛋白較膜錨定蛋白、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白和核定位蛋白而言，能誘發(fā)更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。雖然本研究只觀察了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白和核定位蛋白對(duì)體液免疫反應(yīng)的影響，但也證實(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白較核定位蛋白更易誘發(fā)強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)?？梢?，表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)定位對(duì)于基因免疫誘發(fā)的體液免疫反應(yīng)具有顯著影響。因此，在設(shè)計(jì)以誘發(fā)體液免疫為目的的基因免疫載體時(shí)，應(yīng)考慮到表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)改造，使其易于暴露并被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，將有利于誘發(fā)高水平體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，這對(duì)于基因疫苗的研制和基于基因免疫的特異性抗體的制備具有一定的指導(dǎo)作用。

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Effects o f intrace llular localiz ation of pr oteins expr essed by DNA vaccines on humoral immunity response upon DNA immunization

YANG Jun, CHEN Xiao-li, WANG Yi-li, SI Lü-sheng

ObjectiveTo analyze whether different intracellular location of expressed proteins may affect humoral immunity response upon DNA immunization.MethodsEGFP-HPV16 L1 and EGFP-HPV16L1△NLS fusion genes were amplified from pFB-EGFP-HPV16L1 and pFB-EGFP-HPV16L1△NLS plasmid, respectively, then were recombined into pcDNA3.1(+) vector to generate recombinant pcDNA-EGFP-HPV16L1 and pcDNA -EGFP-HPV16L1△NLS plasmid, respectively. The recombinant plasmids were transfected into CHO cells and fluorescences of EGFP tagged fusion proteins were observed under fluorescent microscope. The recombinant plasmids were subsequently injected into the tibial muscles to immunize BALB/c mices and titers of the antisera were determined using ELISA.ResultsThe EGFP-HPV16 L1 and EGFP-HPV16L1△NLS were correctly inserted into pcDNA3.1 (+) vectors. EGFP-HPV16 L1 fusion protein could be detected in the nucleus of CHO cells, while the EGFP-HPV16L1△NLS fusion protein was located in the cytoplasm of CHO cells. The two recombinant plasmids could induce humoral immunity response in BALB/c mices. After three times of immunization, the A450values of antisera of pcDNA -EGFP-HPV16L1△NLS plasmid immunized mices group were higher than that of recombinant pcDNA-EGFP-HPV16L1immunized mices group (P ＜ 0.001).ConclusionIntracellular localization of the proteins expressed by DNA vaccines could affect humoral immunity response upon DNA immunization. Proteins localized in the cytoplasm could induce stronger humoral immunity response compared with proteins localized in the nucleus upon DNA immunization. The conclusion is very useful to design DNA vaccine to induce stronger humoral immunity response or to produce antibody upon DNA immunization.

Antibody formation; Immunotherapy; Nuclear location signal; DNA immunization

YANG Jun, Email: yangjundr@yahoo.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（30300305）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”（NCET-10-0647）；教育部博士點(diǎn)新教師基金（2007-0698106）

710004 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科（楊軍、陳曉黎）；710061 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院癌癥研究所，生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王一理、司履生）

楊軍，Email：yangjundr@yahoo.com.cn

2012-03-12

方法利用分子克隆技術(shù)，分別構(gòu)建能表達(dá)不同細(xì)胞定位的EGFP-HPV16L1 融合蛋白和截短型 EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體；通過轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞，并在倒置熒光顯微鏡下觀察表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞定位；用重組pcDNA 載體免疫 BALB/c 小鼠；EGFP 作為抗原，ELISA法檢測(cè)血清抗體吸光度。

結(jié)果①重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1 轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞核內(nèi)可見到綠色熒光，pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見到綠色熒光；②兩種不同的重組 pcDNA 載體均可誘導(dǎo) BALB/c 小鼠體液免疫反應(yīng)，但重組 pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表達(dá)載體免疫組小鼠 IgG 抗體 A450值顯著高于重組pcDNAEGFP-HPV16L1 真核表達(dá)載體免疫組小鼠 IgG 抗體 A450值（P ＜ 0.001）。

結(jié)論表達(dá)產(chǎn)物的不同細(xì)胞定位可影響基因免疫誘發(fā)的體液免疫應(yīng)答水平，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白分子較定位于細(xì)胞核的蛋白分子能誘導(dǎo)機(jī)體更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，這為以增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)為目的的基因疫苗的設(shè)計(jì)提供了參考。

Author Affiliations:The Second Hospital, College of Medicine, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710004, China (YANG Jun, CHEN Xiao-li,); The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education, Institute for Cancer Research, School of Life Science ＆ Technology, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061, China (WANG Yi-li, SI Lü-sheng)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):270-275