異氟醚麻醉對老年大鼠海馬微管相關(guān)蛋白tau剪切的影響

張曉光 薛張綱 倉靜

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海 200032）

吸入麻醉藥可加重阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的神經(jīng)病理改變。AD的神經(jīng)病理特征為神經(jīng)細(xì)胞外以β淀粉樣蛋白（amyloidβ，Aβ）沉積為核心形成斑塊，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)以過磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau為核心形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）和神經(jīng)細(xì)胞丟失。有研究［1］顯示異常剪切的tau蛋白也是NFT的成分之一［1］。異氟醚可以促進(jìn)γ分泌酶的作用，增加Aβ的表達(dá)，促進(jìn)Aβ寡聚化，增加Aβ的細(xì)胞毒性［2］；它還可以活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3），誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，使β淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloidβ precursor protein，APP）分裂酶和γ分泌酶的含量增加，并促進(jìn)Aβ的表達(dá)［3］。但目前尚無報(bào)道表明異氟醚是否可以促進(jìn)tau蛋白的剪切。Tau－C3是tau蛋白在D421位點(diǎn)被剪切后產(chǎn)生的片段。本研究旨在探討異氟醚麻醉對Sprague Dawley（SD）老年大鼠海馬Tau－C3含量的影響及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物處理 將16只Sprague Dawley（SD）老年大鼠（＞18個(gè)月）隨機(jī)分為對照組（n＝8）和麻醉組（n＝8）。將麻醉組大鼠置于氣密性良好有機(jī)玻璃麻醉箱中，進(jìn)氣口與麻醉機(jī)呼吸回路相連，出氣口與麻醉氣體監(jiān)測儀連接以監(jiān)測麻醉箱內(nèi)異氟醚、O2及CO2的濃度。載氣中O2濃度為40%，新鮮氣體流量為2L／min。當(dāng)氣體監(jiān)測儀上顯示異氟醚濃度達(dá)到1.5%時(shí)開始計(jì)時(shí)，使呼氣末異氟醚濃度維持在1.5%～2%，異氟醚吸入時(shí)間為6h。對照組吸入氣體中不含異氟醚，其他條件與麻醉組相同。觀察大鼠的呼吸頻率、幅度以及皮膚粘膜顏色。監(jiān)測肛溫，將麻醉箱置于水浴中，使大鼠肛溫維持在35.5～36.5℃。

1.2 免疫組化多重標(biāo)記 用8%水合氯醛腹腔注射（300mg／kg）麻醉大鼠后，迅速打開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室灌流200mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛溶液（Sigma－Aldrich）200mL；然后剝離腦組織，將其放入4%多聚甲醛，于4℃冰箱內(nèi)固定48h。固定后用10%、20%和30%蔗糖溶液依次沉底后，進(jìn)行冰凍切片，片厚度為15μm。自前中海馬部位開始切片，5張作為1套切片，每只大鼠取1套切片留備免疫組化染色。每張切片任意選取2個(gè)視野（×400），計(jì)數(shù) Tau－C3陽性的細(xì)胞數(shù)、c－Casp3陽性的細(xì)胞數(shù)以及Tau－C3和c－Casp3均為陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.3 免疫印跡法 將大鼠的海馬組織放入1.5mL Eppendorf管中，稱質(zhì)量后，放入液氮中凍存。加入裂解液后在冰上用玻璃勻漿器勻漿后置于冰上裂解1h。以14 000r／min的速度于4℃ 離心30min，收集上清液并將其分裝后保存于－80℃。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測每個(gè)樣品的總蛋白濃度，并補(bǔ)加裂解液調(diào)整使各個(gè)樣品的蛋白濃度相近后，按照常規(guī)的免疫印跡法進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 麻醉組老年大鼠海馬Tau－C3的含量顯著高于對照組 麻醉組Tau－C3陽性細(xì)胞數(shù)為（5.6±2.4）個(gè)／高倍視野，而對照組為（2.5±1.2）個(gè)／高倍視野，2組間有顯著差異（t＝3.041，P＜0.01）。麻醉組Tau－C3免疫印跡條帶的相對光密度也顯著高于對照組，見圖1。

圖1 Tau－C3免疫印跡條帶及光密度統(tǒng)計(jì)圖

2.2 Tau－C3的增加與caspase－3的激活無關(guān) 免疫組化多重標(biāo)記的結(jié)果顯示，95%的Tau－C3陽性細(xì)胞內(nèi)并無c－Casp3，見圖2。

圖2 免疫組化多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 異氟醚麻醉不能引起老年大鼠腦內(nèi)的c－Casp3增加 免疫印跡的結(jié)果顯示，麻醉組和對照組老年大鼠腦內(nèi)均僅檢測到極少量的c－Casp3，且2組間c－Casp3的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 c－Casp3的免疫印跡條帶及光密度統(tǒng)計(jì)圖

3 討 論

近年來的研究［4］顯示異常剪切的tau蛋白在AD的病理中也占有重要地位。異氟醚是一種臨床常用的吸入麻醉藥，顯示異氟醚麻醉可以促進(jìn)tau蛋白病的轉(zhuǎn)基因動物模型—tauP301L轉(zhuǎn)基因小鼠的tau蛋白磷酸化、聚集以及從微管上解離。

本研究發(fā)現(xiàn)異氟醚麻醉組老年大鼠海馬Tau－C3的含量顯著高于對照組。異氟醚促進(jìn)tau蛋白磷酸化是由于異氟醚麻醉導(dǎo)致低體溫的原因。本研究中采取保溫措施，避免了低體溫的干擾，大鼠在麻醉過程中亦無缺氧的表現(xiàn)。

Xie［3］等通過一系列研究證實(shí)異氟醚在細(xì)胞水平可以增加caspase－3表達(dá)、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及增加Aβ表達(dá)。研究顯示，AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Tau－C3含量的增加與caspase－3激活無關(guān)［5］。通過免疫組化多重標(biāo)記的方法，本研究發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)Tau－C3陽性的神經(jīng)元內(nèi)并無c－Casp3存在；免疫印跡的結(jié)果也提示異氟醚麻醉并不能增加老年大鼠腦內(nèi)c－Casp3的含量。由此我們推測異氟醚麻醉使老年大鼠腦內(nèi)tau蛋白的剪切產(chǎn)物的增加與caspase－3的激活無關(guān)。

［1］ Zhang Q，Zhang X，Sun A.Truncated tau at D421is associated with neurodegeneration and tangle formation in the brain of Alzheimer transgenic models［J］.Acta Neuropathol，2009，117（6）：687－697.

［2］ Eckenhoff RG，Johansson JS，Wei H，et al.Inhaled anesthetic enhancement of amyloid oligomerization and cytotoxicity［J］.Anesthesiology，2004，101（3）：703－709.

［3］ Xie Z，Dong Y，Maeda U，et al.The common inhalation anesthetic isoflurane induces apoptosis and increases amyloid beta protein levels［J］.Anesthesiology，2006，104（5）：988－994.

［4］ Delobel P，Lavenir I，F(xiàn)raser G，et al.Analysis of tau phosphorylation and truncation in a mouse model of human tauopathy［J］.Am J Pathol，2008，172（1）：123－131.

［5］ Zhang Q，Zhang X，Chen J，et al.Role of caspase－3in tau truncation at D421is restricted in transgenic mouse models for tauopathies［J］.J Neurochem，2009，109（2）：476－484.