血小板微粒體與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究進展

蕭 云綜述，陳煜森審校

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524000）

血小板微粒體(Platelet microparticles，PMP)主要為血小板在受到不同刺激作用下細(xì)胞膜向外伸展變形，細(xì)胞膜部分以出芽方式形成小囊泡或偽足脫落進入微循環(huán)而形成的細(xì)小微粒，是血小板粘附或活化的產(chǎn)物。PMP的體積小于正常的血小板，直徑0.1～1.0 μm，但具有完整的膜結(jié)構(gòu)，其膜的成分與血小板相同，表達(dá)一些血小板的膜糖蛋白（GP）、血小板活化因子（PAF）、β-淀粉樣前體蛋白、Ca2＋依賴性蛋白酶（Calpain）和有促凝作用的磷脂等。PMP是血液循環(huán)中含量最多的微粒體，占所有微粒體的70%～90%，在多種生理和病理過程中起著重要作用。正常人血液中含有少量PMP。本文就血小板微粒體的生物特性、檢測及其在缺血性腦卒中的研究進展做一綜述。

1 血小板微粒體的生物學(xué)特點

1.1 血小板微粒體的來源及形成機制 體內(nèi)PMP主要來源于活化的血小板；而體外研究PMP的產(chǎn)生，必須先通過各種途徑激活血小板。目前研究發(fā)現(xiàn)高切應(yīng)力和多種激活劑，如凝血酶、膠原、腎上腺素、ADP、鈣離子載體A23187及終端補體復(fù)合物C5b-9、抗血小板抗體等有關(guān)，作用于血小板均可引起PMP的釋放，但不同的激活劑誘導(dǎo)所產(chǎn)生的PMP大小相差甚遠(yuǎn)。PMP的形成和釋放機制目前尚不十分清楚，但普遍認(rèn)為細(xì)胞膜極性丟失及細(xì)胞膜骨架重排起到重要的作用。

細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層中的脂質(zhì)成分呈不對稱分布，帶負(fù)電荷的氨基磷脂（磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺）幾乎全部分布在膜靠近胞質(zhì)的內(nèi)層，而磷脂酰膽堿和鞘脂主要分布在膜的外層。細(xì)胞通過酶消耗能量來維持膜脂質(zhì)不對稱性，在此過程中氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶、翻轉(zhuǎn)酶（Flippase）和磷脂爬行酶（Scramblase）起到重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到促凝、促炎癥等刺激時通常引起胞外Ca2+內(nèi)流或胞內(nèi)Ca2+貯存庫的釋放，導(dǎo)致胞漿Ca2+濃度升高，進而氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶和Scramblase激活，同時Flippase受到抑制，最終致使膜磷脂重新分布，磷脂酰絲氨酸（PS）由膜內(nèi)層遷移至外層，引起PS暴露、出芽。鈣離子流增加還可以活化Calpain，從而引起細(xì)胞骨架蛋白分子的變化。Calpain活化使細(xì)絲蛋白與肌球蛋白裂解，打亂維持支撐細(xì)胞膜的正常細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，可引起細(xì)胞收縮和細(xì)胞骨架重建，細(xì)胞外形改變、出芽，這些隆起的泡狀物擠壓胞膜并脫落，因此脫落的細(xì)胞微粒整合了一部分的源細(xì)胞膜表面蛋白和其他成分。

研究發(fā)現(xiàn)早期凋亡的血小板通過細(xì)胞膜骨架的重塑和出芽方式也可以產(chǎn)生血小板微粒體。早期凋亡的細(xì)胞產(chǎn)生微粒體依賴于pho相關(guān)的激酶ROCK1，這個酶是通過CASPASE蛋白酶裂解介導(dǎo)激活的，通過裂解激活的ROCK1可以促進細(xì)胞膜中肌球蛋白輕鏈的磷酸化以及肌動蛋白肌絲耦合斷裂，進而引起細(xì)胞膜骨架的重排，最終導(dǎo)致微粒體的產(chǎn)生。

2009年，F(xiàn)laumenhaft等[1]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)中鼠和人的巨核細(xì)胞中可產(chǎn)生CD41及CD61陽性的微粒，但不同于血小板分泌的PMP，不表達(dá)CD62或LAMP-1，而且細(xì)胞骨架含量下降，為健康人群中PMP絕對組成部分。2010年，Rank等[2]發(fā)現(xiàn)骨髓經(jīng)過放射后，循環(huán)血中CD61陽性微粒大部分消失，而CD62陽性微粒繼續(xù)存在，進一步支持了巨核細(xì)胞來源的PMP。

1.2 血小板微粒體的生物學(xué)功能。

1.2.1 促凝血功能[3]PMP具有促凝血活性，來自血小板激活過程中所釋放的其表面富含的PS、Ⅷ因子和Va因子。PS促進了細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用及在Ca2+存在的條件下促凝血；Ⅷ因子為Tenase酶復(fù)合物形成的協(xié)同因子；Va因子結(jié)合Xa因子后可形成凝血酶原酶的復(fù)合物。雖然Ⅷ因子連接血小板是不穩(wěn)定的，但Ⅷ因子和Va因子可穩(wěn)定地結(jié)合于PMP的表面，因此PMP可以不依賴血小板的激活而促進凝血，且這種促凝血活性比血小板激活所致的凝血能夠持續(xù)更長的時間。PMP經(jīng)血小板活化形成之后，又可通過其含有的PAF、Calpain、PS等直接活化血小板，并且通過GPⅠb與內(nèi)皮下基質(zhì)結(jié)合作為底物促進血小板進一步粘附于內(nèi)皮細(xì)胞。此外，PMP還可通過與內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞的作用而促進血小板的活化。

1.2.2 抗凝血功能 PMP可通過抑制蛋白C激活Va因子通路而抑制凝血功能，蛋白C的抑制劑可結(jié)合于血小板和PMP表面的磷脂酰乙醇胺，從而有效抑制磷脂所激活的蛋白C的通路。目前認(rèn)為PMP具有的抗凝活性可能與磷脂在內(nèi)外小葉之間的不完全翻轉(zhuǎn)有關(guān)，但以促凝血還是抗凝血為主的具體機制仍需要進一步研究探討[4-5]。

1.2.3 傳遞生物信息的作用 PMP通過與靶細(xì)胞發(fā)生粘附，將其胞膜上生物活性物質(zhì)或胞漿成分傳遞給靶細(xì)胞，從而影響靶細(xì)胞的生物學(xué)功能。例如：PMP可激活平滑肌細(xì)胞MAPK p42/44的通路[6]；PMP通過轉(zhuǎn)移CD41抗原而增強骨髓來源的造血干細(xì)胞對膠原蛋白的粘附能力[6]；PMP表達(dá)CXCR4，可將其傳遞給CXCR4(-)細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致這些細(xì)胞獲得對HIV的易感性[7]。

2 血小板微粒體的檢測方法

目前大約75%的實驗室在使用流式細(xì)胞儀（FCM）測定PMP，是最常用的檢測方法。但其他細(xì)胞如紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、白細(xì)胞等也能產(chǎn)生直徑小于1.0 μm的微顆粒，細(xì)菌塵粒等污染都可能干擾PMP的定量測定。FCM測定法可利用PMP表面的抗原熒光抗體對其膜上的特異蛋白進行標(biāo)記，進一步對其加以區(qū)別，然后根據(jù)其前向角散射光（FS）及熒光強度（FL）進行定量檢測。常用的方法有：全血法、富含血小板血漿（PRP）法、乏血小板血漿（PPP）法、內(nèi)參定位法及改良流式細(xì)胞術(shù)等。PRP法樣品處理過程簡單，只需制備PRP，避免了PPP法中多次離心所造成的PMP丟失，成為大多數(shù)實驗室的首選方法。

流式細(xì)胞儀檢測微粒的大小受到波長的限制，小于0.5 μm的微粒很難檢測到，盡管新型的流式細(xì)胞儀和使用微球定位能檢測到0.3 μm的微粒，甚至更小的微粒，但是通過對比其他檢測技術(shù)（如原子力量顯微鏡），發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀低估了PMP的數(shù)量[8]。此外，由于PMP亞型的性質(zhì)不同，單用某種抗體標(biāo)記物也可以低估PMP的數(shù)量。

在檢測過程中由于使用流式細(xì)胞儀機器型號、樣本處理、參數(shù)設(shè)置及分析方法不同，導(dǎo)致FCM測定的血小板微粒體數(shù)量范圍在100～40 000/μl之間廣泛波動，因此國際血栓與止血協(xié)會的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會發(fā)布了FCM標(biāo)準(zhǔn)化PMP檢測指南[9]，而且被證實能在不同實驗室可靠檢測PMP[10]。在檢測之前，樣本的處理也同樣要標(biāo)準(zhǔn)化，包括樣本的離心步驟，冰凍、抗凝、延遲時間、運輸、保存、融解等環(huán)節(jié)亦需進一步探討[11-12]，但這方面的報道比較少，此外，分析方法亦需要一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

一些新的技術(shù)如以阻抗為基礎(chǔ)的流式細(xì)胞術(shù)、電化學(xué)阻抗分析、原子力量顯微鏡、動態(tài)光散射檢測在PMP的檢測取得很大的進展，特別是可以不管微粒的大小檢測所有的微粒，但上述儀器昂貴稀少以致難以有效廣發(fā)應(yīng)用，并且缺乏有效的抗體分子標(biāo)記物?？偠灾?，盡管FCM存在缺陷，但因其操作簡便，速度快和結(jié)果準(zhǔn)確，目前仍是最好檢測PMP的方法，特別是臨床應(yīng)用。

3 血小板微粒體在缺血性腦卒中的臨床意義

3.1 血小板微粒體與不同亞型缺血性腦卒中的相關(guān)性 1996年，Bulboac?[13]用電子顯微鏡觀察到缺血性腦卒中患者血小板活化釋放微囊泡（Microvesicles），而健康個體中觀察不到這種現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)一名特發(fā)性血少板減少性紫癜（ITP）伴有進展性認(rèn)知功能障礙的患者，血樣中PMP數(shù)量明顯增高?；仡櫡治鲞@些患者發(fā)現(xiàn)，沒有出血癥狀的患者比有出血癥狀的患者PMP增高，伴有認(rèn)知功能障礙的患者PMP增高更明顯，這些患有認(rèn)知功能障礙的患者經(jīng)MRI證實有腦缺血疾病，因此推測PMP在ITP患者中替代了血小板功能而限制出血，在高水平時誘發(fā)腦微血管的血栓形成[14]。隨后Ahn等[15]通過增加觀察樣本及采用更先進的影像學(xué)檢測進一步證實了上述觀點。于是在非ITP的缺血性腦血管疾病患者中是否能觀察到PMP增高這個問題引起了廣泛興趣。Lee等[16]及其研究團隊觀察了短暫性腦缺血（TIA）、小血管腦卒中、大血管腦卒中、多發(fā)性硬化及阿爾茨海默病患者，發(fā)現(xiàn)除了阿爾茨海默病外，都能夠觀察到PMP數(shù)量增高，而且小血管腦卒中比大血管腦卒中增多得更明顯，因此，推測長期及高水平的PMP或者某些亞型PMP可能會誘導(dǎo)腦缺血。1998年，在人工心臟瓣膜患者的研究中，Geiser等[17]首次報告了腦血管疾病與外周血PMP之間的病理生理聯(lián)系。

3.2 在缺血性腦卒中急性期的血小板微粒體變化 在腦梗死的急性期可以發(fā)現(xiàn)外周血PMP水平升高。2003年，Cherian等發(fā)現(xiàn)[18]，在腦梗塞急性期，外周血PMP升高與內(nèi)皮功能異常的標(biāo)記物P-選擇素和E-選擇素等相關(guān)，而且E-選擇素血液濃度的升高與全部類型腦梗死強相關(guān)，特別是由大動脈的動脈粥樣硬化所致的腦梗死。2009年，Kuriyama等[19]拿發(fā)現(xiàn)在腦梗塞急性期血液中的PMP（ELISA法評估）水平升高，而其升高與頸動脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）和頸動脈顱內(nèi)段狹窄相關(guān)。與心源性中風(fēng)的患者相比，大腦前、后、中動脈腦梗死及腔隙性腦梗死患者的PMP水平顯著性升高，這可能有助于心源性和血栓性中風(fēng)之間的鑒別診斷。小血管閉塞或大血管閉塞所致急性期腦梗塞的PMP水平均比對照組高，其升高與伴隨的IMT、顱內(nèi)動脈狹窄顯著性相關(guān)，這些證據(jù)是非常支持血液PMP水平可作為動脈粥樣硬化斑塊的生物評價的重要指標(biāo)[20]。Csongrádi等[21]在肥胖患者中發(fā)現(xiàn)PMP水平與IMT以及動脈粥樣硬化其他危險因素存在正相關(guān)，進一步支持上述觀點。

3.3 在缺血性腦卒慢性期中的血小板微粒體變化 在腦梗死慢性期，外周血PMP水平仍然升高，并且未受一些特殊的抗血小板治療所影響（阿司匹林聯(lián)合西洛他唑）[22]。而相反，TIA患者經(jīng)抗血小板治療（阿司匹林和氯吡格雷的組合）可使外周血PMP下降[23]。由于PMP的水平在腦梗死慢性期與腦梗死急性期比較仍然是不變的，因此，腦梗死患者PMP可能是腦動脈粥樣硬化斑塊的剪應(yīng)力增加評估的特異生物指標(biāo)。Maria等[24]在評估腦梗死慢性期血小板活性及反應(yīng)性時發(fā)現(xiàn)，PMP水平增高與P-選擇素呈負(fù)相關(guān)，血小板活性逐漸增高，PMP分離現(xiàn)象占主導(dǎo)優(yōu)勢，容易受到抗血小板藥物的影響。由于PMP促凝作用及血栓形成的特性，不利于腦梗死預(yù)后。因此，腦梗死患者PMP的評估不僅顯示血小板活化，而且可顯示內(nèi)皮功能障礙，可能是一個重要的預(yù)后參數(shù)。

3.4 治療缺血性腦卒的潛在策略 盡管目前對PMP水平增高誘發(fā)了腦梗死還是腦梗死導(dǎo)致PMP水平增高仍存在爭議，但2008年Ahn就提出了將降低PMP作為治療腦梗死的手段。抑制PMP的形成或者阻斷各細(xì)胞來源微粒體的相互作用是兩種基礎(chǔ)的方法。目前已經(jīng)清楚有幾種微粒體抑制劑，例如Calpain抑制劑，然而這些藥物是否適合人體內(nèi)使用仍在探索階段。PMP抑制劑還可以明顯抑制來源于內(nèi)皮細(xì)胞的微顆粒形成，獲得收益遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其已知的藥理學(xué)作用。

綜上所述，PMP主要來源于活化的血小板，參與正常生理及病理情況下的止血過程，可反映血栓或血栓前狀態(tài)。FCM檢測PMP的方法具有操作簡單及客觀精密等優(yōu)點，為其在臨床的廣泛應(yīng)用提供了有效的檢測手段。PMP的定量檢測對腦梗死的診斷、治療和預(yù)后評估有重要意義。PMP在腦缺血性疾病發(fā)病機制中起重要作用，但其具體作用機制仍不清楚；抑制PMP形成成為治療腦梗死的新策略，但缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持；已知幾種抑制PMP生成的藥物，但在人體實驗中尚缺乏穩(wěn)定性。深入研究PMP的生理病理效應(yīng)將為進一步揭示腦梗死的發(fā)病機制、特異性治療方法及預(yù)防提供重要的理論依據(jù)。

[1]Flaumenhaft R,Dilks JR,Richardson J,et al.Megakaryocyte-derived microparticles:direct visualization and distinction from platelet-derived microparticles[J].Blood,2009,113:1112-1121.

[2]Rank A,Nieuwland R,Delker R,et al.Cellular origin of platelet-derived microparticles in vivo[J].Thromb Res,2010,126:255-259.

[3]Horstman LL,Ahn Y S.Platelet microparticles:a wide-angle perspective[J].Oncol/Hematol,1999,30(2):111-142.

[4]Horstman LL,Jy W,Bidot CJ,et al.Antiphospholipid antibodies:paradigm in transition[J].J Neuroinflammation,2009,6:3.

[5]Moake JL.Thrombotic microangiopathies[J].N Engl J Med,2002,347:589-600.

[6]Baj-Krzyworzeka M,Majka M,Pratico D,et al.Platelet-derived microparticles stimulate proliferation,survival,adhesion,and chemotaxis of hematopoietic cells.Exp[J].Hematol,2002,30(5):450-459.

[7]Rozmyslowicz T,Majka M,Kijowski J,et al.Platelet-and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CX-CR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV[J].AIDS,2003,17(1):33-42.

[8]Yuana Y,Oosterkamp TH,Bahatyrova S,et al.Atomic force microscopy:a novel approach to the detection of nanosized blood microparticles[J].J Thromb Haemost,2010,8:315-23.

[9]Robert S,Poncelet P,Lacroix R,et al.Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer:a first step towards multicenter studies?[J].J Thromb Haemost,2009,7:190-197.

[10]Lacroix R,Robert S,Poncelet P,et al.Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry using calibrated beads:results of ISTH SSC collaborative workshop[J].J Thromb Haemost,2010,8:2571-2574.

[11]Mobarrez F,Antovic J,Egberg N,et al.A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles[J].Thromb Res,2010,125:110-116.

[12]Orozco AF,Lewis DE.Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma[J].CytometryA,2010,77:502-514.

[13]Bulboac?.A-Evaluarea func?ionalit??ii plachetare ?n boala cerebrovascular?,Tez? de doctorat,UMF Cluj-Napoca,1996.

[14]Jy W,Horstman LL,Arce M,et al.Clinical significance of platelet microparticlesin autoimmune thrombocytopenias[J].JLab ClinMed 1992,119:334-345.

[15]Ahn YS,Horstman LL,Jy W,et al.Vascular dementia in patients with immune thrombocytopenic purpura(ITP)[J].Thromb Res,2002,107:337-344.

[16]Lee YJ,Horstman LL,Janania J,et al.Elevated platelet microparticles in transient ischemic attacks,lacunar infarcts,and multiinfarct dementias[J].Thromb Res,1993,72:295-304.

[17]Geiser T,Sturzenegger M,Genewein U,et al.Mechanisms of cerebrovascular events as assessed by procoagulant activity,cerebral microemboli,and platelet microparticles in patients with prosthetic heart valves[J].Stroke,1998,29:1770-1777.

[18]Cherian P,Hankey GJ,Eikelboom JW,et al.Endothelial and platelet activation in acute ischemic stroke and its etiological subtypes[J].Stroke,2003,34:2132-2137.

[19]Kuriyama N,Nagakane Y,Hosomi A,et al.Evaluation of factors associated with elevated levels of platelet-derived microparticles in the acute phase of cerebral infarction[J].Clin Appl Thromb Hemost,2010,16(1):26-32.

[20]Kuriyama N,Nagakane Y,Hosomi A,et al.Evaluation of factors Associated with elevated levels of Platelet-derived microparticles in the Acute Phase of Cerebral Infarction[J].Clin Appl Thromb Hemost,2009,4:1076-1087.

[21]Csongrádi E,Nagy B Jr,Fulop T,et al.Increased levels of platelet activation markers are positively associated with carotid wall thickness and other atherosclerotic risk factors in obese patients[J].Thromb Haemost,2011,106(4):683-692.

[22]Shirafuji T,Hamaguchi H,Kanda F.Measurement of platelet-derived microparticle levels in the chronic phase of cerebral infarction using an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Kobe J Med Sci,2008,54:55-61.

[23]Serebruany VL,Malinin AI,Pokov AN,et al.Antiplatelet profiles of the fixed-dose combination of extended-release dipyridamole and lowdose aspirin compared with clopidogrel with or without aspirin in patients with type 2 diabetes and a history of transient ischemic attack:a randomized,single-blind,30-day trial[J].Clin Ther,2008,30:249-259.

[24]Lukasik M,Rozalski M,Luzak B,et al.Platelet activation and reactivity in the convalescent phase of ischaemic stroke[J].Thromb Haemost,2010,103(3):644-650.