昆蟲美洲大蠊天然產(chǎn)物的研究及其化學(xué)分類學(xué)意義

尹衛(wèi)平，姜亞玲，李鵬飛，李文淵，高 婷

(河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南洛陽471003)

0 前言

相對(duì)于植物化學(xué)和海洋生物化學(xué)，昆蟲次生代謝物是發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物藥物來源的一個(gè)更為珍稀的研究資源，具有獨(dú)特的生物活性和多樣性特征［1－2］。美洲大蠊(Periplaneta americana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱蟑螂(見圖1)。該蜚蠊科蜚蠊屬昆蟲，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界有70多種，熱帶和亞熱帶地區(qū)比較常見，中國有近30種［1］。中國蜚蠊，已知重要種類有:美洲大蠊、黑褐大蠊、日本大蠊、澳洲大蠊、德國小蠊，均為常見的室內(nèi)害蟲［3］。其中，美洲大蠊在中國分布極廣，喜歡在溫暖潮濕的場所孳生。前胸、背板淡黃色，背板中部有赤褐至黑褐色的蝶形大斑［4］。

圖1 美洲大蠊成蟲

大部分的蟑螂都是雜食性，與人類的食性重疊，食物種類非常廣泛。部分蟑螂對(duì)人類的家居都有很強(qiáng)的入侵性，它們繁殖力強(qiáng)，在人類家居棲身及覓食的同時(shí)，蟑螂可攜帶致病的細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌以及寄生蠕蟲的卵，傳播多種病原體，可人工感染導(dǎo)致亞洲霍亂、肺炎、白喉、鼻疽、炭疽以及結(jié)核等病的細(xì)菌，又稱病媒害蟲。因此，蟑螂是一種世界性衛(wèi)生害蟲，與人類關(guān)系密切，危害甚篤。雖然蟑螂攜帶多種病原體，但一般認(rèn)為病原體在它們體內(nèi)不能繁殖，屬于機(jī)械性傳播媒介［5］。

作者在最近有關(guān)昆蟲化學(xué)抗菌活性的研究中［6］，發(fā)現(xiàn)美洲大蠊的提取物對(duì)枯草桿菌表現(xiàn)出抑菌活性。在前期生物活性研究的指導(dǎo)下，本文以美洲大蠊為研究對(duì)象，從美洲大蠊的抗菌活性組分中分別分離得到一個(gè)新的異黃酮化合物和兩個(gè)已知的次生代謝化合物，包括一個(gè)異黃酮化合物和一個(gè)甾醇類化合物，其中，新化合物對(duì)革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(ATCC strain 6633)有明顯抗菌活性。并對(duì)這些昆蟲次生代謝物中的化學(xué)分類學(xué)意義做了簡要討論。

1 試驗(yàn)材料、儀器與試劑

1.1 儀器與試劑

冷凍干燥機(jī)(德國Martin Christ，ALPHA 1-2LD plus);凈化工作臺(tái)(蘇州凈化，SW-CJ-2G);Waters 600E高效液相色譜儀:梯度二元泵，2487紫外檢測器;分析柱:4.6 mm×150 mm，C18，5μm Sunfire;制備柱:10 mm×150 mm，C18，10μm Sunfire柱;Waters自動(dòng)餾分收集儀。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)用昆蟲

干燥的美洲大蠊成蟲，系2010年4月購于安徽亳州人民大藥房，由洛陽梓生科技開發(fā)有限公司王忠東總工鑒定，樣品標(biāo)本(No:IPA2010-B)存放于河南科技大學(xué)天然產(chǎn)物研究室。

1.2.2 分離柱及填料硅膠

柱層析硅膠(試劑級(jí)，粗孔zcx-II，200～300目，100～200目，青島海洋化工廠分廠)，薄層層析硅膠(化學(xué)純，HG/T2354—92，GF254，青島海洋化工廠分廠)。柱規(guī)格根據(jù)樣品的質(zhì)量進(jìn)行選擇，以達(dá)到最佳的分離目的，本試驗(yàn)所用到的層析柱規(guī)格有5 cm×100 cm、3 cm×75 cm和2.5 cm×42 cm。

1.2.3 供試菌種和培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ATCC strain 6633和大腸桿菌(E.coli)O157:H7。

2 方法

2.1 粗提物抗菌活性測定

2.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

按照培養(yǎng)基配方稱取相應(yīng)成分的質(zhì)量，加入到合適的容器中，而后加入蒸餾水?dāng)嚢柚廖镔|(zhì)完全溶解，測量pH值，根據(jù)測得的pH值大小，加入稀NaOH或稀HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.5。高溫滅菌30 min后待用。固體培養(yǎng)基的方法同液體培養(yǎng)基配方，在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入1.2%的瓊脂即得。

2.1.2 試驗(yàn)樣品及對(duì)照品的配制

各種昆蟲分別以二氯甲烷浸泡2次，每次2 d，濾出蟲體，合并濾液，減壓回收溶劑，得昆蟲脂溶性成分蟲蠟。濾渣蟲體被干燥，再次用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇浸泡2次，每次2 d，合并濾液冷凍干燥后得到昆蟲粗提物。將粗提物置超低溫(－60℃)冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 粗提物抑菌活性測定

將上述昆蟲粗提物，即70%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇浸膏分別配制成15 mg/mL和30 mg/mL，分別以革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ATCC strain 6633和革蘭氏陰性大腸桿菌(E.coli)O157:H7為受試菌種，70%甲醇溶劑作為空白對(duì)照，以青霉素鈉鹽(濃度分別為1 mg/mL和10 mg/mL)為陽性，測定昆蟲提取物抗菌活性，觀察并記錄抑菌圈大小。

粗提物藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，70%甲醇浸膏對(duì)革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(ATCC strain 6633)有抑菌活性，當(dāng)最小抑菌濃度值分別為30 mg/mL和15 mg/mL時(shí)，抑菌圈的直徑分別為12 mm和7 mm。美洲大蠊粗提物對(duì)革蘭氏陰性菌均無敏感性。

2.2 美洲大蠊70%甲醇部位分離純化

以粗提物抗革蘭氏陽性菌活性測定結(jié)果為依據(jù)，在生物活性的指導(dǎo)下，取70%甲醇提取物5.2 g進(jìn)行硅膠柱層析分離，依次用CHCl3和CH3OH洗脫劑(w(CHCl3)∶w(CH3OH)=10∶0，9∶1，7∶3，1∶1，3∶7，1∶9，0∶10)進(jìn)行梯度洗脫，收集每個(gè)餾分為30 mL。對(duì)各餾分進(jìn)行薄層色譜分析，合并相同組分，最終得到PⅠ～PⅧ共8個(gè)組分。其中PVI組分有固體析出，過濾后，固體用CHCl3-(CH3)2CO重結(jié)晶，最終得到一淡黃色無定形粉末，記為化合物1(14 mg)。對(duì)組分PⅢ再次進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以EtOAC-CH3OH進(jìn)行梯度洗脫，至EtOAC-CH3OH(4∶6)時(shí)獲得經(jīng)TLC和高效液相色譜分析得到一淡黃色固體化合物2 (12 mg)。對(duì)組分PⅠ再次進(jìn)行硅膠柱色譜分離，當(dāng)洗脫劑至w(CHCl3)∶w(CH3OH)=9∶1時(shí)，得到一白色粉末狀物質(zhì)，記為化合物3(18 mg)。

3 結(jié)果與討論

3.1 純品化合物的鑒定

化合物1:淡黃色無定形粉末，C26H28O6，HRESI-MSm/z［M+H］+436.188 6(calcd 436.188 2)。核磁共振氫譜信號(hào)顯示，該化合物在芳區(qū)共有7個(gè)氫，其中有2個(gè)鄰偶的dd分裂峰，分別在δH6.66 (dd，2H，J=8.4 Hz)和7.04(dd，2H，J=8.4 Hz);δH7.22(dd，1H，J=6.6 Hz)和7.28(dd，1H，J=6.6 Hz)。另外，有一個(gè)孤立的氫信號(hào)在δH7.27處，上述氫譜特征揭示該化合物是一個(gè)黃酮類的化合物。13C NMR在δC176.9(C-4)，153.4(C-2)，123.6(C-3)和157.0(C-5)顯示可能是一個(gè)7，8位取代基的異黃酮結(jié)構(gòu)［7］，而且δC130.2(×2，C-2’，C-6’)，115.1(×2，C-3’，C-5’)和δC159.2 (C-4’)證明分子中含有對(duì)位甲氧基苯在C-1(δC122.0，C-1’)［8－9］與異黃酮的3位相連接。核磁共振二維譜揭示，在HMBC譜圖的Me-19到C-12(δC128.3)相關(guān)交叉，及Me-20到C-12 (δC128.3)的相關(guān)交叉信號(hào)，驗(yàn)證了C-7和C-8上取代基的存在。分子中其他相關(guān)交叉峰在H-11到C-7，C-8，C-12和C-14示意在C-7和C-8位有一含氧環(huán)烷取代基的存在。從H-6到 C-5，C-7和C-8在C-12(δC128.3)相關(guān)交叉信號(hào)，進(jìn)一步確證為異戊醇基的存在。

另外，在1HNMR高場區(qū)δH4.32～0.82的信號(hào)范圍，共有10余個(gè)氫，顯示含有一個(gè)含氧環(huán)烷取代基的存在［7］。相應(yīng)的核磁共振碳譜信號(hào)在δC72.5(C-O)和δC29.2，29.0(CH3×2)，δC129.8和128.3 (-C ＝C-)，可以判斷為一個(gè)環(huán)氧二甲基單環(huán)烯碎片的基團(tuán)的存在［10］。羥基取代的異戊烯取代基信號(hào)被歸屬為δC35.9(CH2)，24.1(CH2)，63.0(C-OH)，24.7(CH3)和20.6(CH3)。因此，比較該類黃酮類化合物骨架結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［8，10］，確定化合物1的結(jié)構(gòu)，見圖2?；衔?被命名為12-(16-羥基，17，18-二甲基)-異戊醇基-13-氧代(19，20-二甲基)-駢［7－8］環(huán)氧己烯基-△11，12-3-(4’-甲氧基)-苯基-5-羥基異黃酮。

化合物2:淡黃色固體，C15H10O5，HRESI-MSm/z［M+H］+270.182 0(calcd 270.182 2)。根據(jù)數(shù)波譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，確定化合物2為黃酮類化合物。1H NMR和13C NMR與已知化合物高金雀花堿的光譜數(shù)據(jù)一致，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照，鑒定化合物2為高金雀花堿［8，11］，化合物2的結(jié)構(gòu)見圖3。該化合物的化學(xué)名稱為5，7-二羥基-4’-羥基苯基異黃酮。

圖2 化合物1的結(jié)構(gòu)

化合物3:淡黃色固體，質(zhì)譜分析HRESI-MS m/z［M+H］+428.432 8(calcd 428.432 6)。確定該化合物分子式為C30H52O。核磁共振氫譜顯示1H NMRδH5.35 (d，H-6，H)，3.50(m，1H，H-3)，1.02(3H，s，H-19)，0.68 (3H，s，H-18)揭示出具有典型的甾體化合物的骨架。核磁共振碳譜13CNMR信號(hào)在δC140.8(C-5)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，11.9(C-18)，19.4(C-19)，18.8(C-21)與已知3β-OH膽甾-5-烯化合物波譜數(shù)據(jù)一致［8］。最終確定該化合物為25-甲基-3β-羥基-膽甾-5-烯。該化合物結(jié)構(gòu)見圖4。

圖3 化合物2的結(jié)構(gòu)

3.2 純品化合物的生物活性測試

對(duì)上述3種化合物分別進(jìn)行藥敏抗菌試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1對(duì)革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(ATCC strain 6633)有抑菌活性，最小抑菌濃度值為10 mg/mL，抑菌圈的直徑為9 mm。3個(gè)化合物對(duì)革蘭氏陰性菌均無敏感性。

3.3 昆蟲次生代謝物的化學(xué)分類學(xué)意義

圖4 化合物3的結(jié)構(gòu)

本文從昆蟲美洲大蠊中共分離得到3個(gè)化合物，他們分別是異黃酮類(化合物1和化合物2)和甾醇類(化合物3)化合物。兩個(gè)異黃酮化合物中，化合物1是新化合物。作為異黃酮類化合物組分是植物化學(xué)研究中較常見的一類化合物。該類化合物尤其在被子植物中分布廣泛，包括莧科，?？疲箍?，薔薇科等植物中?；衔?(高金雀花堿)通常存在于豆科植物中，具有雌激素樣作用［12］。此外據(jù)報(bào)道，高金雀花堿也可以從海洋微生物中獲得。甾醇類化合物3也廣泛分布于植物中。然而作為昆蟲次生代謝物研究，這些化合物均首次在蟑螂中分離得到，也是首次從蜚蠊科昆蟲中獲得。

基于化合物基源分析調(diào)查，眾所周知，蟑螂是一種植食性昆蟲。綜上研究結(jié)果表明:從蟑螂中得到的這3個(gè)化合物，其分子骨架結(jié)構(gòu)與植物中的次生代謝物是一樣的。不可否認(rèn)，這些小分子代謝物也可能是昆蟲從植物中攝取的。在目前階段，無法證明新的異黃酮衍生物(化合物1)是否存在于植物中，還是由蟑螂自身代謝所產(chǎn)生。然而，此研究有助于闡明植物和昆蟲在自然條件下得以共同進(jìn)化的原理，從而證明昆蟲與植物次生代謝物在生態(tài)和生物活性上，既具有部分作用或反作用關(guān)系，又有與其各自生命活動(dòng)相關(guān)而產(chǎn)生的獨(dú)特活性物質(zhì)的修飾表達(dá)和衍生的新化合物與植物化學(xué)的相關(guān)關(guān)系。但是作為化學(xué)分類學(xué)被應(yīng)用于昆蟲學(xué)的分類，仍在探索之中。昆蟲化學(xué)的進(jìn)一步研究，將分析昆蟲天然產(chǎn)物的起源、功能及其次生代謝物的重要生態(tài)學(xué)，有助于揭示昆蟲天然產(chǎn)物分子的生物學(xué)分子相關(guān)機(jī)制和昆蟲次生代謝物的生物起源問題。

致謝:感謝鄭州大學(xué)測試中心的朱衛(wèi)國教授，對(duì)本文中所有化合物的波譜數(shù)據(jù)的測定。

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