蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑抑制胃癌生長的研究

王海波 蔡慎初 徐曉峰 吳式琇 黃慶科

當(dāng)前我國胃癌的防治現(xiàn)狀是“三高三低”:發(fā)病率高、病死率高、轉(zhuǎn)移率高，早期診斷率低、手術(shù)根治率低、5年生存率低?；熥鳛橹委熚赴┲匾闹委煼绞?，特別是對無法切除的胃癌病人中占主導(dǎo)地位，雖然近10年來胃癌的化療效果得到長足的進(jìn)步，但至今仍無國際統(tǒng)一的“金標(biāo)準(zhǔn)”方案，與此同時，腫瘤耐藥、免疫抑制等因素使多數(shù)體質(zhì)虛弱的患者無法按期進(jìn)行化療，而中醫(yī)藥在治療胃癌上有抑瘤、調(diào)節(jié)免疫、延長帶瘤生存期、提高生存質(zhì)量、減輕化療不良反應(yīng)等優(yōu)勢［1～3］。

蔡氏扶正消癥湯系國家級名老中醫(yī)蔡慎初教授所創(chuàng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蔡氏扶正消癥湯能有效抑制人胃癌SGC－7901細(xì)胞增殖［4］。本研究擬進(jìn)一步探討蔡氏扶正消癥湯單獨及聯(lián)合奧沙利鉑對體內(nèi)外胃癌生長的抑制作用，并初步探討其可能機制，為蔡氏扶正消癥湯的臨床應(yīng)用提供一定的實驗參考。

材料與方法

1.材料:奧沙利鉑(江蘇恒瑞公司);胎牛血清、RPMI－1640培養(yǎng)基和含EDTA胰蛋白酶(美國Gibco公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒和CCK－8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);AnnexinⅤ－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司);Bax、Bcl－2和β－actin抗體(美國Abcam公司);免疫組化SP試劑盒(北京中山金橋公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng):人胃癌細(xì)胞株SGC－7901購自中國科學(xué)院上海生化和細(xì)胞生物研究所。將SGC－7901細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，生長至70%～80%培養(yǎng)瓶面積時胰蛋白酶消化傳代。

3.實驗動物:BALB/c裸鼠40只，雄性，體重18～22g，鼠齡4～5周，溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于該動物實驗中心SPF屏障系統(tǒng)潔凈層流架內(nèi)。

4.蔡氏扶正消癥湯水煎劑的制備:蔡氏扶正消癥湯由黃芪、人參、溫莪術(shù)、藤梨根、露蜂房、八月札、白毛根、徐長卿、全蝎等藥物組成。藥材經(jīng)三蒸水漂洗3次，置燒杯中煎煮30min去渣，8層紗布過濾，60～80℃隔水蒸，濃縮成生藥1g/ml，并調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2后4℃保存?zhèn)溆茫R用前再以3000r/min離心5min去渣。

5.CCK－8法檢測細(xì)胞增殖:收集處于對數(shù)生長期的SGC－7901細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板每孔接種4×103個細(xì)胞，過夜貼壁后分別加入25μg/ml的奧沙利鉑、20mg/ml的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯(lián)合作用，每組6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞加入等量的PBS)。按照試劑盒說明各孔加入CCK－8溶液10μl，酶標(biāo)儀測各組A450值后計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組A450值－空白調(diào)零A450值)/(對照組A450值－空白調(diào)零A450值)× 100%。

6.AnnexinⅤ－FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡:收集處于對數(shù)生長期SGC－7901細(xì)胞，藥物處理同上，按試劑盒說明用500μl Binging Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5μl AnnexinⅤ －FITC和5μl PI后混勻，室溫下避光10 min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率。

7.Western blotting檢測細(xì)胞中Bax和Bcl－2表達(dá):25μg/ m l的奧沙利鉑、20 mg/ml的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯(lián)合處理對數(shù)生長期的SGC－7901細(xì)胞24h后，胰酶消化，4℃下1000r/min離心5min收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(含50mmol/ L Tris pH 8.0，150mmol/L NaCl，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.0，0.1%十二烷基酸鈉(SDS)，1%Triton X－100)在冰上裂解細(xì)胞30min，4℃下12000r/min離心15min，收集細(xì)胞裂解液，以Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白質(zhì)(30微克/孔)以12%分離膠電泳分離蛋白，5%脫脂奶4℃封閉過夜后滴加兔抗人Bax和Bcl－2抗體為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

8.人胃癌裸鼠移植瘤的建立和給藥方案:取5×106個對數(shù)生長期的SGC－7901細(xì)胞懸浮于0.2ml無血清1640培養(yǎng)基中，注射到裸鼠腋部皮下建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，共制備40只胃癌皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機分為對照組、奧沙利鉑組、蔡氏扶正消癥湯組和聯(lián)合組(n=10):對照組每只裸鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.2ml;蔡氏扶正消癥湯給藥采用灌胃，劑量為10g/kg體重，相當(dāng)于人體給藥劑量的5倍，每日1次，連續(xù)使用30天;奧沙利鉑給藥采用腹腔內(nèi)注射，劑量為5mg/kg體重，隔天給藥1次，連用7次。蔡氏扶正消癥湯給藥結(jié)束后14天，處死動物并仔細(xì)剝離腫瘤組織，稱重后計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1－治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%

9.免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中Bax和Bcl－2表達(dá):所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片。按照免疫組化SP試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，并以PBS代替一抗作為陰性對照。高倍鏡(×400)下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，共計數(shù)1000個細(xì)胞。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:無陽性細(xì)胞為陰性(－)，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為弱陽性(+)，10%～50%為中度陽性(++)，＞50%為強陽性(+++)。Bcl－2以細(xì)胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色顆粒為陽性，Bax蛋白以細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒為陽性。

10.統(tǒng)計學(xué)方法:實驗所得計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x± s)的形式表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差檢驗、秩和檢驗和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對SGC－7901細(xì)胞增殖和凋亡的變化:25μg/m l的奧沙利鉑、20mg/m l的蔡氏扶正消癥湯生藥及兩藥聯(lián)合處理SGC－7901細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率分別為81.26%±10.26%、75.12%±8.95%和57.56% ±5.56%，聯(lián)合用藥組與各單藥組以及對照組相比較，均有顯著性差異(P＜0.05);蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑作用24h誘導(dǎo)19.65%±2.08%的胃癌細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，與蔡氏扶正消癥湯單藥組12.35%±1.67%和奧沙利鉑組7.77%±1.21%以及對照組2.14%±0.56%相比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，蔡氏扶正消癥湯組和奧沙利鉑組細(xì)胞早期凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對SGC－7901細(xì)胞中Bax和Bcl－2表達(dá)的影響:如圖1所示，與對照組相比較，奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯均可上調(diào)SGC－7901細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平，聯(lián)合用藥組中Bax蛋白表達(dá)升高更明顯;而奧沙利鉑對SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2表達(dá)無明顯抑制作用，但蔡氏扶正消癥湯單獨及聯(lián)合奧沙利鉑可顯著抑制SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達(dá)。

圖1 Western blotting檢測蔡氏扶正消癥湯和奧沙利鉑對胃癌SGC－7901細(xì)胞中Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響

3.奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對裸鼠胃癌皮下移植瘤生長的抑制作用:治療結(jié)束后，各組鼠重均有不同程度的降低，對照組、奧沙利鉑組、蔡氏扶正消癥湯組和聯(lián)合用藥組裸鼠體重下降分別為0.26± 0.11g、1.1±0.34g、0.35±0.06g和0.46±0.16g，聯(lián)合用藥組裸鼠體重下降明顯低于奧沙利鉑單藥組(P＜0.05);另外奧沙利鉑組裸鼠治療期間均出現(xiàn)不同程度腹瀉和裸鼠脫水等不良反應(yīng)，但療程結(jié)束也隨之停止，而蔡氏扶正消癥湯組和聯(lián)合用藥組裸鼠的胃腸道反應(yīng)則較奧沙利鉑組明顯減輕，僅30%裸鼠出現(xiàn)少量稀便(P＜0.05)。實驗第34天處死動物，奧沙利鉑組腫瘤平均重量為0.41±0.15g，與對照組0.78 ±0.23g相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，抑瘤率為47.43%;蔡氏扶正消癥湯組腫瘤平均重量為0.70± 0.21cm3，與對照組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);聯(lián)合用藥組腫瘤平均重量為0.26±0.08g，抑瘤率為66.67%，與對照組和各單藥組相比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。

4.奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對裸鼠胃癌皮下移植瘤組織中Bax和Bcl－2表達(dá)的影響:免疫組織化學(xué)染色可見對照組中大量細(xì)胞Bcl－2呈陽性表達(dá)，少數(shù)細(xì)胞Bax呈陽性表達(dá)(圖2);與對照組相比較，奧沙利鉑組中Bax蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞比率增加，而Bcl－2陽性表達(dá)無明顯影響;蔡氏扶正消癥湯組腫瘤組織中Bax和Bcl－2的表達(dá)相對對照組分別上調(diào)和下調(diào);與對照組相比較，聯(lián)合用藥組中Bcl－2陽性表達(dá)細(xì)胞顯著減少，而Bax陽性表達(dá)細(xì)胞明顯增多。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測奧沙利鉑和蔡氏扶正消癥湯對裸鼠胃癌皮下移植瘤中Bax和Bcl－2表達(dá)的影響(×400)

討論

目前，化療是治療胃癌的主要手段之一，奧沙利鉑作為治療胃癌的一線化療藥物之一，但奧沙利鉑單獨治療胃癌的效果不理想，同時化療的不良反應(yīng)較大［2］。因此尋求一種安全有效的方法增強傳統(tǒng)化療藥物奧沙利鉑在胃癌中的療效受到越來越多的關(guān)注。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療胃癌方面有其自身的優(yōu)點:癥狀改善顯著，不良反應(yīng)小，全身狀態(tài)保持較好，病情發(fā)展較慢，病人腫瘤相關(guān)指標(biāo)可下降，腫瘤亦可縮小或帶瘤較長期生存［3］。因此中醫(yī)藥抗腫瘤研究成為當(dāng)前研究的熱點之一。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蔡氏扶正消癥湯不僅能有效抑制人胃癌SGC－7901細(xì)胞增殖，還有抑制胃癌血管生成的作用［4，5］。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)蔡氏扶正消癥湯對人胃癌細(xì)胞株SGC－7901有明確的增殖抑制作用，同時流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明蔡氏扶正消癥湯作用人胃癌SGC－7901細(xì)胞后誘導(dǎo)更多的早期凋亡細(xì)胞，從而表明蔡氏扶正消癥湯對人胃癌SGC－7901細(xì)胞生長抑制方式可能是以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式為主;同時本研究表明蔡氏扶正消癥湯可增強奧沙利鉑對體外胃癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。為進(jìn)一步驗證蔡氏扶正消癥湯單獨及聯(lián)合奧沙利鉑對體內(nèi)胃癌生長抑制作用，筆者建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，體內(nèi)實驗結(jié)果表明蔡氏扶正消癥湯單獨對體內(nèi)胃癌皮下移植瘤無明顯生長抑制作用，考慮到中藥抗腫瘤治療起效較慢，可能與本次體內(nèi)實驗時間安排過短有一定關(guān)系;但蔡氏扶正消癥湯可顯著增強奧沙利鉑對體內(nèi)胃癌生長抑制作用，表明蔡氏扶正消癥湯確切的抗體內(nèi)胃癌生長的療效;同時在本次體內(nèi)實驗期間，奧沙利鉑表現(xiàn)出一定的不良反應(yīng)，但蔡氏扶正消癥湯不僅對實驗動物未表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，同時可削弱奧沙利鉑對瘤荷裸鼠的不良反應(yīng)，進(jìn)一步表明蔡氏扶正消癥湯在增強傳統(tǒng)化療藥物療效的同時，還可提高傳統(tǒng)化療藥物治療上的安全性，顯示出蔡氏扶正消癥湯應(yīng)用于胃癌治療中的可喜前景。

鑒于目前祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥應(yīng)用于惡性腫瘤治療中鮮有機制探討，本研究中，筆者探討了Bax/Bcl－2在蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑在治療體內(nèi)外胃癌中的作用。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl－2家族起到重要的雙重調(diào)節(jié)作用，凋亡抑制蛋白Bcl－2能阻止細(xì)胞通過線粒體通道途徑發(fā)生凋亡，而另一Bcl－2家族蛋白成員Bax能對抗凋亡抑制蛋白Bcl－2的作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］;最新研究表明，百里醌可通過抑制Bcl－2的表達(dá)從而增強奧沙利鉑對惡性腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，同時對正常細(xì)胞無明顯不良反應(yīng)［7］。在本試驗中，蔡氏扶正消癥湯不僅能上調(diào)體外胃癌細(xì)胞中Bax表達(dá)水平，還能抑制Bcl－2的表達(dá);另外蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑后更顯著上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl－2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá);同時筆者在裸鼠胃癌皮下移植瘤中也觀察到類似的結(jié)果，從而表明蔡氏扶正消癥湯能調(diào)控Bcl－2家族蛋白，從而發(fā)揮抑制體內(nèi)外胃癌生長的效應(yīng)。

綜上所述，在本研究首次表明，蔡氏扶正消癥湯不僅可明顯增強奧沙利鉑對體外胃癌的生長抑制作用;同時體內(nèi)實驗也表明蔡氏扶正消癥湯應(yīng)用于胃癌治療的安全性和有效性;蔡氏扶正消癥湯單獨或聯(lián)合奧沙利鉑還可上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl－2在體外胃癌細(xì)胞以及體內(nèi)胃癌皮下移植瘤組織中的表達(dá)。因此，筆者推斷，蔡氏扶正消癥湯可靶向調(diào)節(jié)Bax和Bcl－2在胃癌中的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強奧沙利鉑對體內(nèi)外胃癌的抑制作用，而蔡氏扶正消癥湯聯(lián)合奧沙利鉑有望成為新的治療方案應(yīng)用于臨床胃癌治療。

1 Jansen EP，Boot H，Dubbelman R，et al.Postoperative chemoradiotherapy in gastric cancer－a Phase I/II dose－finding study of radiotherapy with dose escalation of cisplatin and capecitabine chemotherapy［J］.Br JCancer，2007，97(6):712－716

2 王婧，田劭丹，陳信義.晚期胃癌治療進(jìn)展［J］.中國腫瘤臨床，2010，37(3):171－175

3 孫大志，許玲，姜林娣，等.中醫(yī)藥治療胃癌臨床研究文獻(xiàn)質(zhì)量的調(diào)查評價［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2003，10(6):833－835

4 郎瑋，謝泳泳，葉人，等.扶正消癥方藥液誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2006，13(5):296－298

5 王海波，葉人，郎瑋，等.蔡氏扶正消癥湯抑制胃癌血管生成的機制研究［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，20(2):49－51

6 Su YT，Chang HL，Shyue SK，et al.Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species－dependent mitochondrial signaling pathway［J］.Biochem Pharmacol，2005，70(2):229－241

7 Banerjee S，Kaseb AO，Wang Z，et al.Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin isaugmented by thymoquinone in pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2009，69(13):5575－5583