核糖體失活蛋白及其在生物醫(yī)學領域的應用與研究進展＊

趙 婷，姚大衛(wèi)，吳志斌，左雨鵬，鄺詠衡，謝天順，馮先玲綜述，沙 鷗△，張 健▲

（1.深圳大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學系，廣東深圳518060；2.香港中文大學醫(yī)學院生物醫(yī)學科學學院，香港999077）

核糖體失活蛋白及其在生物醫(yī)學領域的應用與研究進展＊

趙 婷1，姚大衛(wèi)2，吳志斌2，左雨鵬2，鄺詠衡2，謝天順1，馮先玲1綜述，沙 鷗1△，張 健1▲

（1.深圳大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學系，廣東深圳518060；2.香港中文大學醫(yī)學院生物醫(yī)學科學學院，香港999077）

核糖 體失活蛋白；N－糖苷酶；免疫毒素；細胞因子；逆向運輸

核糖體失活蛋白（ribosome－inactivating proteins，RIPs）是一類具有特殊生物毒性的蛋白。它具有N－糖苷酶活性，可以滅活真核細胞的核糖體，使其蛋白質的生成受阻，從而導致細胞死亡［1］。具體來說，RIPs因其具有N－糖苷酶活性，能夠作用于真核生物28S核糖體RNA大亞基上的莖環(huán)節(jié)構頂部GA4324GA的普遍保守的S／R區(qū)域，通過脫嘌呤作用，阻滯了延長因子EF－2與核糖體的結合，使細胞內核糖體失活，從而不可逆地抑制蛋白質合成［2］，進而引發(fā)細胞凋亡或壞死。RIPs還具有RNA水解酶活性，可以裂解28SRNA的第4 325與4 326位核苷酸之間的磷酸二酯鍵［3－4］。

RIPs的發(fā)現(xiàn)距今已有一百多年的歷史，它是植物產生的一種具有防御和保護自我功能的蛋白質［5－7］。RIPs可存在于植物的各個部位，以種子中的含量最高［8］，并且，不同植物種子中RIPs含量也不同。目前，也有人在某些真菌（如蘑菇）、藻類和細菌（如志賀毒素）中發(fā)現(xiàn)RIPs［9－11］，它們可以抑制蛋白質合成，但作用機制和植物RIPs并不是完全相同［12］。起初發(fā)現(xiàn)它們具有共同的RIPs毒性機制，可以抑制真核細胞核糖體蛋白質生物合成，隨后發(fā)現(xiàn)它們還具有抗病毒、抗細菌、抗增殖、抗腫瘤、抗艾滋病病毒、抗孕及神經毒性等多方面的作用，因此，先后引起農業(yè)領域、生物及醫(yī)學界的廣泛關注。

1 核糖體失活蛋白的分類及其生物學活性

目前，依照RIPs結構的不同，可分為3類（或3型）［13］:一型RIPs為單肽鏈堿性蛋白，相對分子質量為30×103左右，具有RNA N－糖苷酶活性。包凌等［14］研究發(fā)現(xiàn)，一型RIPs一級結構有很高的同源性，二級結構有較多的α－螺旋和β－折疊，它們具有相似的生物學活性。科研人員還從一些葫蘆的種子中分離提純出一些相對分子質量為10×103甚至更小的RIPs，它們的特點是含有豐富的精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺殘基［15］。一型RIPs的單鏈即為具有滅活核糖體功能的活性鏈，具有N－糖苷酶活性，它與細胞膜上磷脂相互作用，通過受體介導的內吞作用進入細胞，但內化效率不高，因此，細胞毒性較小。此外這類RIPs進入細胞的機制還涉及受體非依賴性機制［16］。

二型RIPs為異源二聚體酸性蛋白，分為A、B兩條肽鏈，通過二硫鍵相連，并具有強烈的疏水作用，相對分子質量為60×103左右。A鏈與一型RIPs相似，具有RNA N－糖苷酶活性；B鏈對半乳糖結構具有特定的凝集素活性，能與細胞表面的糖基相互作用，從而幫助A鏈進入細胞發(fā)揮毒性功能。還有一些二型RIPs由4條多肽鏈組成，實際上是由兩個相同的雙鏈RIPs分子通過次級鍵結合在一起的二聚體，其性質與雙鏈RIPs相同，但毒性相差甚遠。最新研究發(fā)現(xiàn)，B鏈除了誘導凋亡或壞死的作用外，還具有誘導破骨細胞分化的功能。這項研究成果，為破骨細胞分化的調節(jié)和骨骼免疫學的研究提供了新的方向［17］。

三型RIPs比較少見，也是一類單鏈蛋白，包括一個與一型RIPs相似的N端區(qū)域和一個未知功能的C端區(qū)域［18］。其先通過合成無活性的前體，然后在涉及形成活性位點的氨基酸之間進行酶解加工才形成成熟RIPs［19］。三型RIPs合成時以無活性的蛋白前體形式存在，當活性位點氨基酸中間的二硫鍵以及C末端和N末端的擴展序列被水解之后，三型核糖體才具有活性。

2 RIPs的應用

2.1 抗孕 一型RIPs中的中藥天花粉蛋白（TCS），是傳統(tǒng)中醫(yī)認可的墮胎藥。研究發(fā)現(xiàn)，TCS是通過殺死絨毛滋養(yǎng)層細胞使胎兒致死。絨毛滋養(yǎng)層細胞對TCS非常敏感，實驗發(fā)現(xiàn)絨毛滋養(yǎng)層細胞攝入大量的TCS分子后，導致絨毛廣泛變性壞死，纖維素沉著，絨毛間隙閉塞及血循環(huán)受到阻斷，血循環(huán)的阻斷又加速絨毛的變性壞死，促使前列腺素釋放而流產。

2.2 抗腫瘤 早在1970年，Lin等［20］就已研究發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素ricin和相思子毒素abrin對小鼠腹水瘤、Yoshida肉瘤、實驗性白血病、B16黑色素瘤有治療作用。通過臨床觀察及實驗室證明，TCS可直接作用于絨毛滋養(yǎng)葉細胞，使之變性壞死并可提高機體的免疫功能，從而提出TCS可作為治療惡性滋養(yǎng)葉腫瘤的選用藥物之一。有研究結果表明，TCS對T淋巴細胞和巨噬細胞衍生的細胞株的殺傷作用主要是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)的，提示TCS的抗腫瘤細胞作用與細胞類型相關的，并且針對不同類型的細胞有其不同的機制。最近有研究顯示，分離純化的蓖麻種子毒蛋白，是具有殺死食管癌細胞的一類RIPs，是穩(wěn)定劑型的蛋白質藥物。

但由于RIPs具有很強的免疫原性，可誘導產生破壞性抗體IgG和IgE，產生一些如過敏反應、神經和腎臟毒性等不良反應，限制了臨床應用。后來，免疫毒素的成功研制，為其在臨床的應用開辟了新的領域，也成為現(xiàn)在醫(yī)學界的研究熱點。免疫毒素是抗體與毒素的偶聯(lián)物，能更好地提高毒素作用的靶向性，從而更有效地發(fā)揮毒素的殺傷效應。其對腫瘤細胞的活性比游離毒素強，一般具有更高的療效和更低的毒性。

2.3 神經科學方面的研究成果及應用 1982年，首先報道于遠端迷走神經和舌下神經內注射蓖麻毒素，該毒素沿神經向神經元細胞傳輸，使核糖體失活，不可逆地抑制蛋白質合成，導致神經元死亡。這種毒素逆向軸漿運輸?shù)淖饔?，造成神經系統(tǒng)的選擇性損傷，稱為“自殺性傳輸”。它們還可以結合單克隆抗體，治成免疫毒素，對特異性的神經元有選擇性的殺傷作用，并被命名為“分子神經外科”。隨后發(fā)現(xiàn)多種RIPs都具有類似神經毒性，如相思豆毒素、蒴蓮根毒素等。一個細胞里大約有10%的核糖體失活，就可以殺死這個細胞。自殺性運輸這種方法多用于實驗用途，如決定神經介質的細胞定位、研究在嚴格限制范圍內神經元丟失后感覺傳到通路和運動系統(tǒng)的可塑性變化、評估初級感覺神經元在自噬行為中的作用等。

由于二型RIPs如蓖麻毒素具有凝集素B鏈，其毒性大，對細胞的選擇性小。而一型RIPs為單鏈活性鏈，其細胞毒性就受到了很大的限制。Sha等［21］對兩個結構相似的單鏈RIPs中藥天花粉蛋白TCS和蓖麻毒素A鏈RTA的神經毒性進行研究后提出，這兩種單鏈RIPs對小鼠視網膜神經細胞都具有毒性，引起小鼠視網膜明顯改變。不同的是，TCS通過凋亡殺死特定部位的視網膜細胞（主要在外核層和內核層），而RTA引起視網膜發(fā)炎，導致細胞壞死。同時發(fā)現(xiàn)RTA的作用機制和二型RIPs中RCA的作用機制相同，說明二型RIPs的B鏈在神經毒性方面可能并不是很必要的。通過這個研究結果提示RIPs可以應用于視網膜模型的創(chuàng)立，TCS可能可以用于視網膜母細胞瘤的化療。

香港中文大學的研究人員還進行了對TCS周圍性神經毒性的實驗研究，發(fā)現(xiàn)TCS通過周圍神經軸突逆向運輸，在相應節(jié)段的脊髓前角運動神經元幾乎全部死亡而相應節(jié)段的背根神經節(jié)的感覺神經元僅部分死亡，顯示出TCS對感覺神經元具有選擇性神經毒性。因此，TCS可以用來誘導神經損害，可能可以用于治療慢性痙攣、痛覺過敏和疼痛等的治療。

2010年，Sha等［22］進一步研究了TCS引起的視網膜神經毒性在細胞通路、神經膠質細胞反應等方面的機制。研究顯示TCS主要通過線粒體退化路徑來誘發(fā)凋亡，TCS可以選擇性地進入視網膜的穆勒膠質細胞和色素細胞，可以引起神經膠質細胞類型和數(shù)量的變化，隨后導致光感細胞死亡。相反的，RTA可以進入血管內皮細胞并破壞血管內皮，導致視網膜炎癥和壞死，更進一步地揭示了TCS對神經系統(tǒng)的毒性機制，提示筆者可以利用RIPs特異性地殺死某些神經，從而減輕這些神經帶來的傷害，如頑固性頭痛，從而為臨床上難治性神經系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。

3 核糖體失活蛋白的檢測

與一型RIPs相比，二型RIPs由于B鏈的凝集素活性，便于進入細胞，產生較強的細胞毒性，在人們的日常生活中，應提高對RIPs作為毒物的認識。如蓖麻毒素毒性極強，為有機磷神經毒素的380倍，氰化物的6 000倍?；谄錆撛诘耐{，如今已根據(jù)RIPs的理化性質和免疫學特性研制出多種快速、靈敏、準確的檢測方法，主要包括免疫熒光技術、夾心免疫PCR技術、免疫膠體金標記技術、蛋白芯片技術和生物傳感器技術等，用于檢測RIPs。有研究表明，納米顆粒探針也能夠用于蓖麻毒素等RIPs的檢測，為人們的生命、生活及食品衛(wèi)生安全提供多方面的保障。

此外，RIPs的檢測手段的應用并不局限于軍事防恐、食品衛(wèi)生方面。有學者發(fā)明了應用酶聯(lián)免疫吸附法測定麻風樹核糖體失活蛋白的方法，為麻風樹的綜合利用提供了技術支持。從而在資源緊缺的今天，使大家可以綜合利用資源，最大可能地少浪費。

4 展 望

綜上所述，RIPs來源廣，易獲得。在生物醫(yī)學界具有抗增殖、抗腫瘤、抗病毒、抗孕、免疫調節(jié)及神經系統(tǒng)毒性作用，具有重要的理論和應用價值。RIPs抗孕、抗腫瘤方面作用，結合更多、更高效的免疫毒素的研制，將會給人類帶來意想不到的收獲。使人們在進行藥物流產時更安全、更有針對性、效果更好，不良反應更小。RIPs在神經系統(tǒng)方面的特性，給神經科學研究提供了更好的研究手段。TCS的選擇性神經毒性作用有望在難治性神經系統(tǒng)疾病方面得到應用。

［1］Endo Y，Tsurugi K.RNA N－glycosidase activity of ricin A chain:mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes［J］.J Biol Chem，1987，262（17）:8128－8130.

［2］Moazed D，Robertson JM，Noller HF.Interaction of elongation factors EF－G and EF－Tu with a conserved loop in 23SrRNA［J］.Nature，1988，334（6180）:362－364.

［3］Perentesis JP，Miller SP，Bodley JW.Protein toxin inhibitors of protein synthesis［J］.Biofactors，1992，3（3）:173－184.

［4］Hartley MR，Lord JM.Cytotoxic ribosome－inactivating lectins from plants［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1701（1／2）:1－14.

［5］Nielsen K，Boston RS.Ribosome－inactivating proteins:a plant perspective［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52:785－816.

［6］Peumans WJ，Hao Q，van Damme EJ.Ribosome－inactivating proteins from plants:more than RNA N－glycosidases［J］.FASEB J，2001，15（9）:1493－1506.

［7］Hartley MR，Lord JM.Cytotoxic ribosome inactivating lectins from plants［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1701（1／2）:1－14.

［8］黃如葵，羅海玲，黃玉輝，等.不同基因型苦瓜種子發(fā)育過程中核糖體失活蛋白的累積變化［J］.南方農業(yè)學報，2011，42（3）:236－239.

［9］Lam SK，Ng TB.First simultaneous isolation of a ribosome inactivating protein and an antifungal proteinmf rom a mushroom（L yophy l2lum shimej i）toget her wit h evidence for synergism of their antifungal effects［J］.Arch Biochem Biophys，2001，393（2）:271－280.

［10］Liu RS，Yang JH，Liu WY.Isolation and enzymatic characterization of lamjapin，t he first ribosome inactivating protein f rom Cry pto2gamic al gal plant［J］.Eur J Biochem，2002，269（19）:4746－4752.

［11］Tesh VL.Activation of cell stress response pathways by shiga toxins［J］.Cell Microbiol，2012，14（1）:1－9.

［12］陳洪章，鄒全明.腸出血性大腸桿菌（EHEC）0157:H7志賀毒素研究進展［J］.中國人獸共患病學報，2007，23（1）:83－85.

［13］郝勇峰，徐雅琴，王麗波.核糖體失活蛋白及其研究進展［C］.生命科學，2011，23（10）:951－956.

［14］包凌，吳民瀘，聶宇，等.苦瓜籽核糖體失活蛋白的基本性質研究［J］.四川大學學報，2009，46（4）:1203－1206.

［15］Ng1TB，Wong JH，Wang H.Recent progress in research on ribosome inactivating proteins［J］.Curr Protein Pept Sci，2010，11（1）:37－53.

［16］Xia XF，Zhang F，Shaw PC，et al.Trichosanthin induces eakage and membrane fusion of liposome［J］.IUBMB Life，2003，55（12）:681－687.

［17］Wang YM，Lu TL，Hsu PN，et al.Ribosome inactivating protein B－chain induces osteoclast differention from monocyte／macrophage lineage precursor cells［J］.Bone，2011，48（66）:1336－1345.

［18］安冉，孫素榮.核糖體失活蛋白在生物醫(yī)學方面的應用研究進展［J］.疾病預防控制通報，2011，26（4）:87－89.

［19］Nielsen K，Boston RS.Ribosome inactivating proteins:a plant perspective［J］.Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52:785－816.

［20］Lin JY，Tserng KY，Chen CC，et al.Abrin and ricin:new antitumour substances［J］.Nature，1970，227（5255）:292－293.

［21］Sha O，Kwong WH，Pang Cho EY，et al.Different neuronal toxicity of single－chain ribosome－inactivating proteins on the rat retina［J］.Toxicon，2008，51（1）:45－53.

［22］Shen WZ，Sha O，Yew DT，et al.Retrograde transport of a traditional chinese medicine，alpha－trichosanthin，and its selective neural toxicity［J］.Clin Toxicol（Phila），2009，47（9）:876－883.

［23］Sha O，Yew DT，Cho EY，et al.Mechanism of the specific neuronal toxicity of a type I ribosome－inactivating protein［J］.Neurotox Res，2010，18（2）:161－172.

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.040

A

1671－8348（2012）34－3663－03

國家自然科學基金面上項目（81171154）；深圳市基礎研究計劃資助項目（JCYJ20120613113228732）。 △

，Tel:（0755）86671918；E－mail:shaou＠szu.edu.cn。▲通訊作者，Tel:（0755）86671997；E－mail:jzhanghappy＠yahoo.com.cn。

2012－06－09

2012－08－22）

·衛(wèi)生管理·