膀胱腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展

王澤民，于 滿

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

2010年，北美膀胱腫瘤新發(fā)患者達(dá)到70530例，同時有14680例死亡病例的致死病因與膀胱腫瘤有關(guān)。膀胱腫瘤已經(jīng)是北美第四常見腫瘤，在惡性腫瘤導(dǎo)致死亡事件中排名第九，男性與女性膀胱腫瘤患者的比例為3:1[1]。在我國，膀胱腫瘤也是常見惡性腫瘤之一，并且膀胱癌發(fā)病率呈上升趨勢，占全部惡性腫瘤的3.2%,90%以上為膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)，其中又以淺表移行細(xì)胞癌為主，術(shù)后約60%-70%復(fù)發(fā)[2]。近年來，新的膀胱腫瘤檢測方法不斷出現(xiàn)，顯著提高了膀胱腫瘤診斷及預(yù)后判斷水平。很多探索研究的膀胱腫瘤分子標(biāo)記物均對膀胱腫瘤的診治有幫助，但目前未發(fā)現(xiàn)特異性及靈敏度出眾的膀胱腫瘤分子標(biāo)記物[3]，尋找這方面的腫瘤標(biāo)記物已成為熱點問題。本文將其研究進(jìn)展綜述如下。

1 核基質(zhì)蛋白(NMPs)

核基質(zhì)蛋白是一種DNA組蛋白，也是細(xì)胞核網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成必需的成份，在基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程中起重要作用，不同腫瘤細(xì)胞均伴隨著核基質(zhì)蛋白成分及結(jié)構(gòu)的不同程度變化。有學(xué)者曾對核基質(zhì)蛋白家族的成員核基質(zhì)蛋白-22(NMP22)進(jìn)行研究，認(rèn)為檢測NMP-22對提高膀胱癌復(fù)發(fā)的判斷有幫助，但尿路上皮細(xì)胞更新脫落的因素很多，導(dǎo)致易發(fā)生假陽性，且假陰性高，未能廣泛用于臨床。膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白-4(BLCA-4)是新發(fā)現(xiàn)的9種膀胱核基質(zhì)蛋白中的一種，只在膀胱癌組織中表達(dá)，而在正常人膀胱組織中缺乏。BLCA-4作為一種轉(zhuǎn)錄因子可引起許多基因表達(dá)的異常，如IL-8是一種炎性細(xì)胞因子，可引起微血管病變，在包括膀胱腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤中都有表達(dá)，并影響著腫瘤轉(zhuǎn)移，高表達(dá)BLCA-4的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-8含量升高12倍，BLCA-4參與了IL-8在膀胱腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控。此外，BLCA-4與IL-1的表達(dá)也有協(xié)同促進(jìn)作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，加快瘤細(xì)胞浸潤。BLCA-4與許多已知因子如AP-2、NF—E1等共同作用于DNA順式作用元件，在膀胱癌的產(chǎn)生中也發(fā)揮重要作用。Konety等[4]通過對膀胱腫瘤細(xì)胞核基質(zhì)研究制備了BLCA-4抗體，并進(jìn)行免疫斑點分析，在膀胱癌組織和癌旁懷疑病變組織均可檢測到BLCA-4表達(dá)，而在正常組織中無陽性發(fā)現(xiàn)，敏感性96.4%，特異性高達(dá)100%，認(rèn)為BLCA-4水平的檢測對提示早期膀胱癌的復(fù)發(fā)有價值。Getzenberg等[5]在正常膀胱組織與膀胱癌組織的對比研究中證實了新膀胱核基質(zhì)蛋白的存在，并指出BLCA-(1-6)在膀胱癌組織中表達(dá)，正常膀胱組織無表達(dá)，其中膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白-4(BLCA-4)的敏感性及特異性均佳，可能作為膀胱癌的特異性標(biāo)志物，對診斷膀胱癌及術(shù)后隨訪有重要價值。Van等[6]在誘導(dǎo)的大鼠膀胱癌模型的研究中發(fā)現(xiàn)，在人工膀胱灌注致癌物后的第8周，BLCA-4已可檢測到表達(dá)，認(rèn)為BLCA-4是膀胱癌發(fā)生的早期事件，對檢測術(shù)后膀胱腫瘤復(fù)發(fā)有參考價值。BLCA的其它成員在膀胱癌診治及術(shù)后隨訪中是否更有意義，目前尚無進(jìn)一步報道。BLCA-4蛋白在膀胱腫瘤中作用的詳細(xì)機(jī)制還需要深入研究，雖然目前尚無商品化試劑盒，但BLCA-4作為一種無創(chuàng)術(shù)后監(jiān)測方法的臨床應(yīng)用前景依然受到關(guān)注。

2 P53蛋白

近年來，P53基因在人類腫瘤中參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡作用有較多研究，P53基因位于人類染色體17p13.1上，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，分野生型和突變型，并分別轉(zhuǎn)錄、翻譯野生型和突變型P53蛋白。野生型P53蛋白半衰期僅6-20min，易水解，一般難以檢測出來，突變型P53蛋白半衰期較長，常在細(xì)胞核內(nèi)聚積，因此，用免疫組化方法檢測到的P53蛋白均為突變型P53蛋白[7]。

2.1 野生型P53基因的作用 野生型P53基因能調(diào)控細(xì)胞增殖，是一種重要的抑癌基因。正常體細(xì)胞P53基因編碼分子量為53 000的核磷酸結(jié)合核蛋白(P53蛋白)，又稱為野生型P53蛋白，野生型P53基因的抗腫瘤作用，可通過調(diào)節(jié)下游效應(yīng)基因MDM2、PIG3等阻止DNA異常的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，影響基因轉(zhuǎn)錄，干擾DNA的起始、啟動細(xì)胞的終末分化和程序化死亡，阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)凋亡[8]。當(dāng)正常細(xì)胞DNA雙鏈?zhǔn)軗p時，可誘導(dǎo)野生型P53基因表達(dá)為P53蛋白并激活，它會降低Topoisomerase II的活性，實現(xiàn)控制細(xì)胞分裂。野生型P53蛋白在轉(zhuǎn)錄水平激活眾多阻止受損細(xì)胞繼續(xù)增殖的基因，如Gadd45基因、周期蛋白G、凋亡誘導(dǎo)因子bax、PUMA基因等，可通過切補(bǔ)修復(fù)、錯配修復(fù)等方式修復(fù)受損DNA，如修復(fù)未成功，則會阻止受損DNA的復(fù)制叉前進(jìn)，抑制DNA的復(fù)制，刺激DNA切除修復(fù)，并激活caspase酶啟動細(xì)胞凋亡程序[9]。Yamauchi等[10]在對鼠進(jìn)行實驗時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鼠胚胎神經(jīng)細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞的DNA損傷后，P53的轉(zhuǎn)錄增加，作用于靶基因Cyclin G1、P21等表達(dá)增強(qiáng)，監(jiān)控組織細(xì)胞增殖和神經(jīng)正常再生。

2.2 突變型P53基因的作用 野生型P53基因是人類腫瘤中較易突變的基因之一，很多腫瘤組織中均有不同程度的P53基因突變，如乳腺癌、肺癌、胃癌及膀胱癌等。突變型P53基因有致癌作用，Braithwaite等[11]研究提示，野生型P53基因突變導(dǎo)致DNA構(gòu)象發(fā)生改變，擴(kuò)增無節(jié)制，失去P53的調(diào)節(jié)后，不但喪失了本身的抑制受損細(xì)胞復(fù)制、誘導(dǎo)凋亡、修復(fù)DNA等抗癌功能，而且可抑制周圍野生型P53基因的正常功能，使癌細(xì)胞更加耐藥。

研究者們對P53在不同分期、分級的膀胱腫瘤及復(fù)發(fā)腫瘤組織中進(jìn)行實驗，試圖發(fā)現(xiàn)P53突變及表達(dá)的規(guī)律。Fu等[12]認(rèn)為P53在良惡性腫瘤中差異明顯，但不同的表達(dá)水平對腫瘤的分期、分級及預(yù)后無顯著作用。而溫機(jī)靈等[13]研究顯示，突變型P53表達(dá)與膀胱腫瘤病理分級、臨床分期呈正相關(guān)，P53表達(dá)顯著升高時，腫瘤極易進(jìn)展，復(fù)發(fā)風(fēng)險高還有學(xué)者[14]對P53在膀胱小細(xì)胞癌中的表達(dá)及對預(yù)后影響的研究認(rèn)為，P53過度表達(dá)在病理分級Gl、G2、G3中分別是6%、28%、71%, Tis-T1期表淺膀胱癌的表達(dá)率為19%T2-T4期表達(dá)率為59%，P53的表達(dá)與膀胱癌的病理分級臨床分期呈正相關(guān)，隨著膀胱腫瘤惡性程度的進(jìn)展，P53蛋白表達(dá)增強(qiáng)。張曉輝等[15]認(rèn)為，復(fù)發(fā)的膀胱移行上皮癌表達(dá)P53較非復(fù)發(fā)膀胱移行上皮癌明顯增多，顯示P53表達(dá)陽性的腫瘤復(fù)發(fā)的可能性大，指出P53的高表達(dá)可以作為膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的指標(biāo)。繼續(xù)深入研究P53在膀胱腫瘤中的作用可以為臨床改善膀胱腫瘤預(yù)后提供新思路。

3 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)

膀胱腫瘤的血管豐富，其生長、浸潤、復(fù)發(fā)等與腫瘤新生血管生成密切相關(guān)。腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移是以供養(yǎng)血管的不斷生成為前提的，當(dāng)腫瘤體積微小時，細(xì)胞通過周圍組織的彌散作用獲得的營養(yǎng)足以維持生存，并可排泄廢物隨著腫瘤的不斷增大，氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)需求增加，新生毛細(xì)血管的長入，使腫瘤組織避免進(jìn)入休眠期，獲得新鮮血液灌注的腫瘤組織開始生長失控，體積倍增，同時，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的生長因子對腫瘤生長有促進(jìn)作用，新血管生成本身就是一種侵襲行為，細(xì)胞間的膠原連接被破壞，形成腫瘤細(xì)胞所喜歡的纖維蛋白基質(zhì)[16]。

3.1 VEGF在腫瘤中的作用 VEGF基因位于人染色體6p12處，其表達(dá)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為34 000-45 000的外分泌性糖蛋白，是目前認(rèn)為特異性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)的調(diào)節(jié)因子，它可以增加血管通透性，使腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管的蔓延，從而加速腫瘤生長與轉(zhuǎn)移，在膀胱腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移中起重要作用[17]VEGF可與細(xì)胞表面受體結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)一系列轉(zhuǎn)錄因子，它使促進(jìn)血管生成的蛋白表達(dá)增多，腫瘤組織形成大量結(jié)構(gòu)和功能異常的血管，給惡變細(xì)胞快速侵襲生長創(chuàng)造了機(jī)會。Jacobsen等[18]在研究影響腎細(xì)胞癌的預(yù)后因素時指出，惡性腫瘤組織可以分泌大量VEGF蛋白，體現(xiàn)在患者的血清中VEGF表達(dá)明顯增高，血清中VEGF水平較高時，損壞微血管基底膜，纖維蛋白容易附著于血管內(nèi)壁，形成血栓，引起癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，形成轉(zhuǎn)移灶，并隨血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)隔器官。

3.2 VEGF的表達(dá)機(jī)制 VEGF的表達(dá)有賴于癌基因的激活、抑癌基因的失活和多種因素(如缺氧等)參與，但VEGF的具體表達(dá)機(jī)制及其調(diào)控還是未知。Weigand等[19]研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞可以自主分泌VEGF，細(xì)胞間質(zhì)中的VEGF又與自身受體結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤血管增殖，并試圖用VEGF siRNA來抑制VEGF的分泌，減少VEGF與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合，實現(xiàn)抗腫瘤目的，結(jié)果顯示是可行的。Wu等[20]在人類膀胱腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)及信號傳導(dǎo)的研究中證實14種膀胱癌細(xì)胞株中有11種細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)表達(dá)1種或1種以上的VEGF受體，VEGF與該類受體結(jié)合可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但阻斷或干擾該信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，使T24細(xì)胞阻滯在G0/G1期。Giatromanolaki等[21]的研究結(jié)果顯示，膀胱腫瘤組織表達(dá)VEGF的路徑受多種因子調(diào)節(jié)，如野生型P53能夠下調(diào)內(nèi)源性VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，并抑制VEGF啟動基因?？梢奦EGF mRNA的大量翻譯需要腫瘤細(xì)胞P53基因突變或丟失，腫瘤組織中突變型P53與VEGF的表達(dá)存在協(xié)同關(guān)系。

3.3 VEGF在膀胱腫瘤中的表達(dá)情況 研究者有不同意見。0’Brien等[22]對53例膀胱標(biāo)本進(jìn)行實驗，其中膀胱癌45例和正常膀胱組織8例，結(jié)果顯示膀胱癌中VEGF的表達(dá)率顯著高于正常膀胱組織，并且復(fù)發(fā)的淺表性BTCC中VEGF的表達(dá)程度是未復(fù)發(fā)者的4倍，作者認(rèn)為VEGF是研究BTCC生物學(xué)行為的重要標(biāo)志物。但Campell等[23]研究結(jié)果說明，膀胱腫瘤組及腫瘤復(fù)發(fā)組VEGF蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，作者并未否認(rèn)VEGF mRNA表達(dá)在不同病理組間存在差異，是什么因素影響了翻譯過程尚不清楚，可能因VEGF會明顯增強(qiáng)其它因素如tsp-1等在膀胱腫瘤生長中的促進(jìn)作用，而實現(xiàn)對腫瘤的間接影響。Crew等[24]報道，VEGF在膀胱癌患者尿液中含量明顯高于健康人群，且復(fù)發(fā)者含量又高于初發(fā)者，認(rèn)為尿中VEGF含量升高預(yù)示膀胱癌的高復(fù)發(fā)風(fēng)險和不良預(yù)后。探索抑制腫瘤血管生長的基因靶點，為臨床膀胱腫瘤基因治療提供了新路徑，VEGF在膀胱腫瘤中的作用機(jī)制需要繼續(xù)研究。

4 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)

自從1978年Miyachi發(fā)現(xiàn)了PCNA基因，一直對PCNA作為增值性標(biāo)志物進(jìn)行研究。PCNA基因位于第20對染色體，其表達(dá)產(chǎn)物PCNA蛋白屬于非組蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)合成，分子量為36 000，它作為細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)是真核生物DNA聚合酶δ(Polδ)的輔助蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)不同部位均有表達(dá)，并直接參加 DNA 的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。當(dāng)細(xì)胞周期開始DNA復(fù)制時，以前導(dǎo)鏈為模板，dNTP為原料合成岡崎片段，PCNA結(jié)合上來，并與其它附屬蛋白形成關(guān)聯(lián)，使DNA聚合酶A松解，在末端與引物分離，再促使DNA聚合酶D與引物連接，這樣進(jìn)入了DNA合成階段[26]。PCNA在增殖細(xì)胞周期中的含量變化與DNA復(fù)制的時相變化均具有明顯的周期一致性, 高水平的表達(dá)提示增殖活躍。Bolton等[25]在PCNA在細(xì)胞周期中表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，PCNA是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤從而進(jìn)入增殖失控狀態(tài)的標(biāo)志性蛋白因子，絕大多數(shù)細(xì)胞在G0-G1期沒有觀察到PCNA的明顯表達(dá)，腫瘤細(xì)胞在G1末期開始顯現(xiàn)出與正常細(xì)胞不同，PCNA的表達(dá)迅猛增加，在S期達(dá)到頂峰，從G2期開始表達(dá)逐漸下降，M期幾乎觀察不到PCNA的明顯表達(dá)。這種變化是與DNA復(fù)制緊密關(guān)聯(lián)的。

PCNA蛋白的表達(dá)程度直觀的反映了細(xì)胞的增殖活躍程度，PCNA含增高時，腫瘤細(xì)胞復(fù)制間期縮短，并且分化程度低，包括胃癌、肝癌和肺癌等惡性腫瘤的研究結(jié)果中均提示類似規(guī)律。PCNA發(fā)揮作用的詳細(xì)機(jī)制還不清楚，Koundrioukoff等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PCNA作為一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白體現(xiàn)了細(xì)胞增殖狀態(tài)，發(fā)揮作用主要是在S期，細(xì)胞進(jìn)入S期后，核內(nèi)會表達(dá)眾多與復(fù)制相關(guān)的蛋白因子，CDK2在核內(nèi)底物水平磷酸化中起重要作用，但需要與PCNA連接后才被激活，PCNA促使CDK2對底物的磷酸化作用，為DNA復(fù)制供能，證明了PCNA與腫瘤增殖活動緊密聯(lián)系?？翟系萚28]認(rèn)為，隨著膀胱腫瘤分級、分期的升高而增強(qiáng)，各級別間腫瘤細(xì)胞著色陽性率差異顯著，PCNA陽性表達(dá)在肌層浸潤性膀胱腫瘤顯著高于非浸潤性腫瘤組織，并且復(fù)發(fā)組也明顯高于初發(fā)組，如果發(fā)現(xiàn)PCNA 陽性率明顯增高，腫瘤很可能已進(jìn)展為浸潤性癌，易復(fù)發(fā)，需密切隨訪。PCNA的免疫組織化學(xué)染色是確定腫瘤細(xì)胞處于增殖周期良好的客觀指標(biāo)。

5 端粒酶(TLMA)

在細(xì)胞周期性增殖過程中，作為染色體短臂的端粒不能保持完整，當(dāng)細(xì)胞DNA因端粒嚴(yán)重缺失而序列混亂時，細(xì)胞無法繼續(xù)復(fù)制而死亡，但端粒酶的存在能以自身RNA為模板，合成端粒DNA，并結(jié)合到染色體端粒缺損處，使端粒末端延長，從而延長細(xì)胞的壽命。端粒酶參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，正常組織中端粒酶表達(dá)水平很低，腫瘤細(xì)胞中多為陽性表達(dá)。端粒酶作為可能的導(dǎo)致膀胱腫瘤的原因受到關(guān)注。Cassel等[29]以端粒酶活性作瘤標(biāo)對膀胱移行細(xì)胞癌患者隨訪研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的端粒酶陽性率與癌旁正常組織差異明顯。端粒酶活性測定已通過體外擴(kuò)增端粒酶(TRAP)法或應(yīng)用RT-PCR測定端粒酶亞單位法開始用于膀胱腫瘤標(biāo)記物的研究。TRAP法應(yīng)用較多，可從至少10個細(xì)胞中快速檢測到端粒酶活性，從而使端粒酶活性檢測在膀胱腫瘤的診斷及隨訪中應(yīng)用成為可能。Erdem等[30]用TRAP法對比端粒酶在膀胱癌患者與健康志愿者的尿液中的活性，總的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為77.4%、93.5%、82.7%、91.1%,并認(rèn)為檢測穩(wěn)定性尚不理想是未臨床推廣的原因。也有學(xué)者報道[31]，端粒酶檢測膀胱癌的結(jié)果并不完全可信，在泌尿系存在結(jié)石、炎癥或BPH患者，該方法假陽性率高達(dá)23.3%，臨床應(yīng)用應(yīng)謹(jǐn)慎。但端粒酶作為還未商品化的腫瘤標(biāo)記物具有廣闊的前景。

6 其它

目前，用于臨床膀胱癌檢測的腫瘤標(biāo)記物還有很多，如Survivin、E-鈣黏素(E-cad)、HAase、BTA、UBC、FN、L-selectin、MCM5、P27、MSI、FB/FDP、BGA、integrin、centrosome等，有的報道取得了較好效果，它們對有膀胱刺激征和血尿的患者篩查及監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)有積極作用，但由于觀察時間短，缺乏循證醫(yī)學(xué)支持，作為臨床診斷的手段還有待進(jìn)一步研究，尚未在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

7 問題與展望

膀胱腫瘤是多基因參與、多分子協(xié)調(diào)、多階段的復(fù)雜疾病，究竟是哪些因素在其發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)的過程中起主導(dǎo)作用，以及這些作用的具體機(jī)制尚不完全清楚，膀胱腫瘤診斷金標(biāo)準(zhǔn)依然是膀胱鏡活檢，對腫瘤標(biāo)記物的研究為膀胱腫瘤早期診斷和術(shù)后監(jiān)測帶來希望。多基因、多蛋白共同推進(jìn)膀胱腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究，為分子靶向治療提供了新思路，分子生物學(xué)標(biāo)記物也有了廣闊的發(fā)展前景，P53、PCNA、VEGF等腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)在臨床上應(yīng)用，很多其它腫瘤標(biāo)記也處于評估階段，幾種腫瘤標(biāo)志物的合理聯(lián)合檢測可能將成為診斷及監(jiān)測膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的有效手段。

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