分子生物學(xué)技術(shù)在布魯菌種型鑒定上的應(yīng)用＊

許鄒亮，南文龍，陳義平＊

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷液研究室，山東青島 266032；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌（Brucella）引起的人畜共患病。全球范圍內(nèi)有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有人、畜布魯菌病存在和流行，給畜牧業(yè)造成重大損失，給人類健康造成嚴(yán)重危害［1－2］。布魯菌為革蘭陰性球桿菌，傳統(tǒng)分類鑒定方法將布魯菌屬分為6個(gè)種19個(gè)生物型，包括羊種布魯菌（B.melitensis，也稱馬爾他布魯菌）1、2、3型，牛種布魯菌（B.abortus，也稱流產(chǎn)布魯菌）1、2、3、4、5、6、7、9型，豬種布魯菌（B.suis）1、2、3、4、5型，犬種布魯菌（B.canis）、綿羊附睪種布魯菌（B.ovis）和沙林鼠種布魯菌（B.neotomae）各有1個(gè)生物型。后來(lái)，歐美學(xué)者又從海洋哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離到不同于上述布魯菌種的布魯菌菌株，暫時(shí)定名為海洋種布魯菌（B.maris），有人建議將其劃分為鯨種布魯菌（B.ceti）和鰭種布魯菌（B.pinnipedialis），但尚未形成統(tǒng)一意見［3］。傳統(tǒng)分類方法往往操作比較繁瑣，鑒定周期長(zhǎng)，需要特定的實(shí)驗(yàn)室條件，并且對(duì)于一些非典型菌株難以進(jìn)行鑒定。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為細(xì)菌分類鑒定提供了新途徑，并使細(xì)菌分類鑒定工作從一般表型鑒定深入到基因型鑒定。分子生物學(xué)方法應(yīng)用于細(xì)菌種型鑒定可在一定程度上克服傳統(tǒng)分型方法的缺陷，具有簡(jiǎn)便快速、結(jié)果判定敏感、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)［4－5］。

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于布魯菌種型鑒定取得了較大進(jìn)展，主要包括多重PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、重復(fù)性基因外回文序列（repetitive extragenic palindromic，REP）、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple locus variable number tandem repeats analysis，MLVA）和熒光定量PCR（real－time PCR）等。

1 多重PCR

Bricker B J等［6］于1994年根據(jù)保守重復(fù)基因序列IS711在布魯菌不同種型間存在的數(shù)目和位置的不同，建立了AMOS－PCR方法，該方法通過(guò)擴(kuò)增帶的大小能夠區(qū)分B.abortus1、2、4 型，B.melitensis1、2、3型，B.suis1型和B.ovis。對(duì)美國(guó)107株野外分離菌株進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果比較，其符合率達(dá)100%。1995年，Bricker B J等［7］又對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，使之能夠鑒別疫苗株S19和RB51，另外，B.canis也由此而得到鑒別，消除了分類中的假陰性。之后數(shù)年，各國(guó)學(xué)者又相繼建立和完善了若干套布魯菌種型鑒定的多重PCR方法，應(yīng)用這些方法可以完成絕大多數(shù)布魯菌種型的鑒定以及疫苗與分離株的區(qū)分［8－10］。相比較而，言AMOS－PCR方法仍是應(yīng)用較多且被公認(rèn)的一種布魯菌種型鑒定的方法。

2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）方法用于布魯菌種型的區(qū)分也多見報(bào)道。Cloeckaert A 等［11］通過(guò)PCR－RFLP方法對(duì)77株布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株和野毒株進(jìn)行鑒定，用9種限制性內(nèi)切酶處理Omp25基因，結(jié)果顯示所有B.melitensis毒株都缺少EcoRV酶切位點(diǎn)，B.ovis毒株在該基因的3′末端缺失了50個(gè)堿基。另外用13種限制性內(nèi)切酶分析Omp2a和Omp2b基因，結(jié)果比Omp25基因呈現(xiàn)出更豐富的多態(tài)性，除了B.canis與B.suis3型和4型無(wú)法區(qū)分外，6種經(jīng)典布魯菌和它們的一些型都能得到鑒別。Cloeckaert A等［12］又基于疫苗株Rev.1的rpsL基因有單堿基突變，用NciⅠ酶切該基因，從而將疫苗株Rev.1與其他布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離株區(qū)分開。

Whatmore A M等［13］用幾種不同的限制性內(nèi)切酶和選擇性引物進(jìn)行AFLP分析，該方法可將B.ovis、B.melitensis、B.abortus、B.neotomae和B.maris野毒株區(qū)分開，但B.canis和B.suis不能進(jìn)行有效區(qū)分。駱利敏等［14］采用AFLP技術(shù)將布魯菌基因組DNA經(jīng)EcoRI／MseI酶切并與相應(yīng)的人工接頭連接后，使用選擇性引物進(jìn)行PCR，成功構(gòu)建了多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的布魯菌DNA指紋圖譜。

3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）是一種DNA指紋多態(tài)性分析技術(shù)，又稱隨意引物PCR（AP－PCR）。Fekete A 等［15］采用了5條隨機(jī)引物 P1、P2、P3、P4和P5對(duì)25株不同布魯菌菌株進(jìn)行AP－PCR鑒定。單獨(dú)使用P1和P2可分別產(chǎn)生7和10種多態(tài)性條帶。P1－258能將疫苗株S19與B.abortus2 308S區(qū)分開；P1－258和P1－1172能將B.abortus2 308S與B.melitensis16M 區(qū)分開；P1－446能將B.canisRM6／66與 其 他7 株 布 魯 菌 區(qū) 分 開；P1－319，P1－537，P1－1010和 P1－1172能將B.ovisANH3572、B.suis1330和B.neotomaeSE－1169區(qū)分開。同樣，10種不同的P2多態(tài)性條帶亦能將不同毒株鑒別開。另外，P3、P4和P5單獨(dú)使用時(shí)分別產(chǎn)生6、6和12種多態(tài)性條帶，成對(duì)使用時(shí)多態(tài)性條帶會(huì)略有不同，但是都能將該25株布魯菌進(jìn)行有效的區(qū)分。Tcherneva E等［16］利用2條10堿基的引物（OPLO4和P5）對(duì)46株布魯菌進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果顯示B.canis和B.suis1型處在同一個(gè)分支上，其他的菌株均可在種的水平上加以區(qū)分。

4 重復(fù)性基因外回文序列和腸桿菌基因重復(fù)一致序列

重復(fù)性基因外回文序列和腸桿菌基因重復(fù)一致序列（REP－PCR／ERIC－PCR）技術(shù)的出現(xiàn)和使用，使得細(xì)菌菌株的親緣關(guān)系、多樣性等方面的研究變得簡(jiǎn)易、快速。崔步云等［17］應(yīng)用REP－PCR以布魯菌屬各種型代表菌株為參考，對(duì)國(guó)內(nèi)分離的典型、非典型布魯菌菌株、疫苗菌株進(jìn)行分類研究，結(jié)果不僅在屬的水平上可以檢測(cè)、鑒定布魯菌，還將107株國(guó)內(nèi)外布魯菌的參考菌株和地方流行菌株分為8個(gè)組。王家熊等［18］利用REP－PCR技術(shù)對(duì)從患者體內(nèi)分離到的3株布魯菌成功進(jìn)行了種的鑒定，結(jié)果均為羊種，與傳統(tǒng)生物學(xué)分型結(jié)果一致。

5 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）也是一個(gè)基于PCR技術(shù)的分型方法，該方法可區(qū)分基因組上多個(gè)具有多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)（VNTR）的重復(fù)數(shù)，因此可用來(lái)區(qū)分菌株的基因型。Bricker B J等［19］首次將MLVA方法用于布魯菌的分型研究，發(fā)現(xiàn)各菌株基因組中的8個(gè)位點(diǎn)均含有一段“AGGGCAGT”的短串聯(lián)重復(fù)序列，PCR擴(kuò)增后計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的串聯(lián)重復(fù)單元的數(shù)目，能夠?qū)⒉剪斁蛛x株進(jìn)行歸類區(qū)分，并將該方法命名為高變八聚體寡核苷酸指紋（HOOF－Prints）。Whatmore A M等［20］利用21個(gè)VNTR位點(diǎn)對(duì)121份來(lái)源于世界各地的布魯菌臨床分離株進(jìn)行分型研究，最終把121份菌株分成119個(gè)基因型，只有2株B.neotomae65／196和65／197與2株B.melitensisUK21／04和UK26／04出現(xiàn)相同的結(jié)果。相關(guān)的研究顯示，MLVA方法Hunter－Gaston分辨率指數(shù)極高，可完成不同源布魯菌株的鑒別，并確定其獨(dú)立的基因型［21－22］。

MLVA分型方法因其穩(wěn)定性好、分辨率高等特點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛采用。其優(yōu)勢(shì)還表現(xiàn)在可以作為流行病學(xué)調(diào)查的工具，確定傳染源及傳播途徑，可以找到菌株之間的關(guān)聯(lián)，確定病人或畜是再感染還是復(fù)發(fā)［23－24］。目前國(guó)際上已有用于布魯菌 MLVA 分型的 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：／／minisatellites.u－psud.fr），研究者可以選擇不同的VNTR位點(diǎn)對(duì)布魯菌菌株進(jìn)行鑒定和歸類。

6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time PCR）技術(shù)對(duì)布魯菌的分種研究主要包括兩種方案，一種是以插入元件IS711為基礎(chǔ)的DNA長(zhǎng)度多態(tài)性為研究對(duì)象，另一種是以DNA單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為分種基礎(chǔ)。

6.1 基于IS711的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Redkar R等［25］在布魯菌插入序列IS711上設(shè)計(jì)上游引物，在插入基因鄰近的單染色體DNA上設(shè)計(jì)下游引物和探針，利用該方法對(duì)已知菌株和臨床分離株進(jìn)行鑒定，結(jié)果所有B.abortus和B.melitensis都能得到有效鑒定，B.suis只能鑒別1型。Hinic V 等［26］利用 普通 PCR 和real－time PCR對(duì)18份布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株和47份布魯菌分離株進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示兩者都能將6種經(jīng)典布魯菌鑒別開，熒光定量PCR的檢測(cè)極限為10個(gè)基因拷貝，可以用于極低細(xì)菌含量的臨床樣本檢測(cè)。相關(guān)研究顯示，基于IS711的常規(guī)real－time PCR，可以有效進(jìn)行布魯菌種水平的鑒定。

6.2 基于SNP的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最普遍的遺傳變異形式，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可研究基因單個(gè)位點(diǎn)的突變，使細(xì)菌種型鑒定成為可能。Gopaul K K等［27］利用SNP設(shè)計(jì)了針對(duì)6種經(jīng)典布魯菌及B.maris的MGB探針，通過(guò)對(duì)300多株布魯菌的鑒定，結(jié)果證明該方法能在種的水平上有效區(qū)分布魯菌，檢測(cè)下限為15個(gè)基因組DNA。Gopaul K K等［28］又利用布魯菌疫苗株基因上的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)MGB探針，能將B.abortusS19、RB51 和B.melitensisRev.1等3種疫苗株與分離株進(jìn)行區(qū)分。Winchell J M 等［29］采用 Real－time PCR 結(jié)合高溶解曲線，應(yīng)用7對(duì)引物對(duì)153份布魯菌分離株進(jìn)行鑒定，與傳統(tǒng)方法比較，其精確度大于99%，并成功地將B.suis從B.canis種中鑒別出來(lái)。

7 小結(jié)

目前，real－time PCR和 MLVA技術(shù)逐漸成為布魯菌種型鑒定的主要分子生物學(xué)方法。應(yīng)用realtime PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行布魯菌的分種靈敏度高、耗時(shí)少，且提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性。但是，目前關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)鑒別布魯菌生物型的檢測(cè)方法研究尚少。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相比，MLVA分析法更容易實(shí)現(xiàn)生物型的鑒別，其分辨率更高，并可方便地實(shí)現(xiàn)全球數(shù)據(jù)共享。RAPD、RFLP及AFLP等種型鑒定方法，雖操作簡(jiǎn)單、成本低廉，但重復(fù)性和穩(wěn)定性稍差?？傊煌牟剪斁N型鑒定方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可根據(jù)技術(shù)條件、時(shí)間、費(fèi)用等多種因素進(jìn)行選擇。當(dāng)遇到一些非典型布魯菌株時(shí)，可同時(shí)采用兩種或兩種以上的方法進(jìn)行鑒定，以達(dá)到準(zhǔn)確分種分型的目的。

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